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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-3163
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10234
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
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Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 14 November 2004 |
Begutachter (Erstgutachter): | Jörg (PD Dr.) Enderlein |
Tag der Prüfung: | 3 November 2003 |
Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik |
Stichwörter / Keywords: | Integrierte Software , Molekularbiologie , , integrated software , molecular biology , artificial genes , protein expression |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 10234 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Synthetische Gene, aus Oligonukleotiden aufgebaute und bis zu mehrere Kilobasen große dsDNA-Fragmente, haben sich bereits in vielen Bereichen der Molekularbiologie und der molekularen Medizin zu einem wertvollen Werkzeug entwickelt. Dennoch wird das hohe Potential dieser Technologie bislang nur zu einem Bruchteil genutzt. Dies liegt vor allem darin begründet, dass trotz enormer Fortschritte der ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Synthetische Gene, aus Oligonukleotiden aufgebaute und bis zu mehrere Kilobasen große dsDNA-Fragmente, haben sich bereits in vielen Bereichen der Molekularbiologie und der molekularen Medizin zu einem wertvollen Werkzeug entwickelt. Dennoch wird das hohe Potential dieser Technologie bislang nur zu einem Bruchteil genutzt. Dies liegt vor allem darin begründet, dass trotz enormer Fortschritte der Aufbau eines synthetischen Gens für den einzelnen Forscher immer noch mühsam und kostspielig ist. Darüber hinaus werden die Möglichkeiten des rationalen Sequenzdesigns mangels geeigneter Software bis jetzt nur unzureichend genutzt. Die Idee liegt jedoch nahe, durch hochgradige Automatisierung des Gensyntheseprozesses eine starke Reduktion sowohl der Synthesekosten als auch der Dauer zu erreichen. Um diesem Ziel näher zu kommen, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein integriertes Softwarepaket erstellt, welches die Hochdurchsatzsynthese artifizieller Gene angefangen beim Design über die Syntheseplanung bis zur Herstellung und Qualitätskontrolle unterstützt.
Kernstück der GeneOptimizer-Software bildet ein benutzerfreundlicher Sequenzeditor, der alle üblichen Bearbeitungsfunktionen beherrscht und das �Reißbrett� für das Sequenzdesign darstellt. Um die (codierende) Sequenz des synthetischen Genes optimal auf den Einsatzzweck und das Expressionssytem anzupassen, müssen häufig mehrere Kriterien, wie Anpassung der Kodonwahl und des GC-Gehaltes, Ausschluss von bestimmten DNA-Motiven und Repetitionen, Vermeidung stabiler Sekundärstrukturen etc. berücksichtigt werden. Durch die Degeneriertheit des genetischen Codes kann allerdings bereits ein sehr kleines Protein durch eine Vielzahl verschiedener DNA-Sequenzen codiert werden. Um eine Sequenz aufzufinden, welche den o.g. Kriterien in möglichst idealer Weise entspricht, wurde ein Algorithmus entwickelt, welcher auf der Verwendung eines �gleitenden Kombinationsfensters� beruht. Innerhalb dieses mehrere Kodons langen Fensters werden alle möglichen Kombinationen synonymer Kodons generiert und jede erzeugte Kombination zusammen mit der bereits optimierten stromaufwärts gelegenen Sequenz durch eine Gütefunktion mit anwendergewichteten Parametern bewertet. Das erste Kodon der optimalen Kombination wird festgelegt und das Kombinationsfenster um eine Aminosäure in 3�-Richtung weitergeschoben. Der Prozess wird so lange wiederholt, bis die gesamte optimierte DNA-Sequenz ermittelt wurde.
Die Software bietet dem Anwender komplementär zu den Optimierungsoptionen eine Vielzahl von Funktionen zur Sequenzanalyse und Sequenzannotation, so dass der Anwender in einem Optimierung-Analyse Feedback-Prozess die Gewichtung der einzelnen Optimierungskriterien so lange verändern kann, bis die Sequenz seinen Vorstellungen entspricht.
Anschließend unterstützt das Programm den Anwender bei der optimalen Unterteilung der Gesamtsequenz in Subfragmente, dem Anfügen optionaler Linkersequenzen und schließlich der Generierung der Oligonucleotidsequenzen. Dabei werden die Oligolängen auf eine bestimmte Schmelztemperatur abgestimmt und der Anwender ebenso vor möglichen Syntheseproblemen durch Fehlhybridisierungen gewarnt.
Das Softwarepaket unterstützt auch den Produktionsprozess, indem die Sequenzen von Subfragmentklonen automatisch auf ihre Übereinstimmung mit der Vorgabesequenz hin bewertet werden. Durch die Klassifizierung von Sequenzfehlern in �sichere Fehler� und �unwahrscheinliche Fehler� (durch fehlerhaftes oder unsicheres Basecalling erzeugt) kann auch bei qualitativ schlechten Sequenzierungsläufen eine hohe Bewertungssicherheit erreicht werden.
Auch bei der finalen Qualitätskontrolle der Gesamtsequenz wirkt die Software durch Alignment- und annotationsfunktionen unterstützend mit.
Mittlerweile wurden über tausend synthetische Gene mit Hilfe der GeneOptimizer Suite entworfen und/oder ihre Herstellung softwareseitig unterstützt.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Synthetic genes, several thousend basepairs long double stranded DNA fragments built from oligonucleotides, have become a valuable tool in many areas of molecular biology and medicine. Nevertheless, the high potential of this technology is used only to a small extent till now. The main reason is, that despite huge progress the production of a synthetic gene is still tedious and expensive for the ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Synthetic genes, several thousend basepairs long double stranded DNA fragments built from oligonucleotides, have become a valuable tool in many areas of molecular biology and medicine. Nevertheless, the high potential of this technology is used only to a small extent till now. The main reason is, that despite huge progress the production of a synthetic gene is still tedious and expensive for the single scientist. Moreover, the possibilities of rational sequence design are hardly used due to a lack in suitable software. Nevertheless, the idea is near to significantly reduce synthesis costs and time by automation of the synthesis process. To approach this goal, an integrated software package was developed in the course of this thesis, which supports the high-throughput synthesis of artificial genes, starting with the design, proceeding with the planning of the synthesis and finally ending with the quality control.
At the heart of the GeneOptimizer Software is a user-friendly sequence editor, which supports all usual editing functions and represents a sketchboard for the sequence design. To fit the (coding) sequence optimally to the experimental requirements and the chosen expression system, often multiple criteria, like adaption of codon usage and GC-content, exclusion of certain DNA-motives and repetitions, avoidance of stable secondary structures have to be taken into consideration. Due to the degeneration of the genetic code even a very small protein can be coded by a huge number of different DNA-sequences. To find a sequence, which fits optimally to the above mentioned criteria, an algorithm was developed, which relies upon a so called �sliding combination window�. Within this several codons long window all possible combinations of synonymous codons are generated and every combination is evaluated together with the already optimized upstream sequence by a scoring function with user defined parameters. The first codon of the optimal combination is chosen and the combination window is moved in 3� direction by one amino acid position. The process is repeated, until the complete optimized DNA-sequence is determined.
The software offers the user many functions for sequence analysis and sequence annotation, which are complementary to the optimization possibilities, so that the user can change the weighting of the used optimization criteria in an optimization-analysis feedback cycle, until the sequence fits his expectations.
Subsequently, the software supports the user in dividing the complete sequence into subfragments, the optional adding of linker sequences and finally the generation of the oligonucleotide sequences. The lengths of the oligos are adjusted to a certain melting temperature and the user is also warned against potential synthesis problems due to false-hybridizations.
The software package supports also the production process by testing the sequences of subfragment-clones for identity with the template sequence. By classification of sequence errors into �confident errors� and �unprobable errors� (generated by false or uncertain basecalling) an evaluation score can be reached with high confidence even with bad-quality sequencing runs.
Also the final quality control of the complete sequence is supported by alignment- and annotation functions.
Meanwhile, over thousand synthetic genes have been designed with the help of the GeneOptimizer suite and/or their synthesis has been aided.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 13:28