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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-4653
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10373
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
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Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 5 Februar 2006 |
Begutachter (Erstgutachter): | Claudia (Prof. Dr.) Steinem |
Tag der Prüfung: | 15 Februar 2005 |
Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik |
Stichwörter / Keywords: | Annexin I , , Annexin A1 , quartz crystal microbalance , model membranes |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 10373 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Annexin A1 bindet nicht nur, wie alle Annexine, Ca2+-abhängig an negativ geladene Phospholipide, sondern kann auch Membranen aggregieren. In dieser Arbeit konnte die Ca2+-abhängige, primäre Bindung von Annexin A1 an negativ geladene, festkörperunterstützte Phospholipidmembranen, getrennt von der sekundären Membraninteraktion, mittels Rasterkraftmikroskopie (SFM) visualisiert und mit Hilfe der ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Annexin A1 bindet nicht nur, wie alle Annexine, Ca2+-abhängig an negativ geladene Phospholipide, sondern kann auch Membranen aggregieren.
In dieser Arbeit konnte die Ca2+-abhängige, primäre Bindung von Annexin A1 an negativ geladene, festkörperunterstützte Phospholipidmembranen, getrennt von der sekundären Membraninteraktion, mittels Rasterkraftmikroskopie (SFM) visualisiert und mit Hilfe der Quarzmikrowaage (QCM)-Technik quantifiziert werden. Für die QCM-Messungen wurden festkörperunterstützte Membranen verwendet, die aus einer Oktanthiol (OT)-Monoschicht und einer zweiten POPC/POPS (4:1)-Lipidschicht bestanden und auf Goldelektroden immobilisiert waren, die auf 5 MHz-Quarzscheiben aufgebracht worden waren. Die QCM-Messungen zeigten, dass Annexin A1 Ca2+-abhängig an POPC/POPS (4:1)-Membranen adsorbiert und nach Entzug der Ca2+-Ionen wieder dissoziiert, wobei die Oberflächenbelegung nach der Adsorption mit steigender Ca2+-Konzentration zunimmt. Messungen der Adsorption und Desorption bei definierten Ca2+-Konzentrationen zeigen, dass Annexin A1 nur partiell reversibel an die Membran bindet und jeweils etwa 60 bis 80 % des Proteins irreversibel adsorbieren. Aus topographischen SFM-Aufnahmen von POPC/POPS (4:1)-Doppelschichten, immobilisiert auf Glimmer, nach Proteininkubation ist ersichtlich, dass irreversibel gebundenes Annexin A1 auf der Membranoberfläche zweidimensionale Aggregate bildet, deren Größe und Verteilung sehr heterogen sind. Aufgrund der Beobachtungen ließ sich ein Modell für die Annexin A1-Membran-Wechselwirkung aufstellen, nach dem Annexin A1 irreversibel an Ca2+-abhängig gebildete PS-reiche Domänen in der Membran adsorbiert und reversibel an die Bereiche zwischen den Domänen bindet. Basierend auf diesem Modell konnten mittels Computersimulationen die Geschwindig-keitskonstanten der Wechselwirkung bestimmt werden. Es zeigte sich, dass die Geschwindigkeitskonstanten der irreversiblen Adsorption konirr um ein bis zwei Größenordnungen größer sind als die der reversiblen Adsorption kon. Für steigende Ca2+-Konzentrationen ergab sich, dass die irreversible Adsorption schneller verläuft und dass die Affinität der reversiblen Bindung zunimmt.
Um die Membranaggregationseigenschaften von Annexin A1 zu untersuchen, wurde mittels der Dissipativen Quarzmikrowaage (QCM-D)-Technik die sekundäre Membran-bindung, getrennt von der primären, durch die Quantifizierung der Vesikeladsorption an membran-gebundenes Annexin A1 charakterisiert. Mit Hilfe der QCM-D-Technik konnte nicht nur die Menge an adsorbierten Vesikeln quantifiziert werden, sondern auch gezeigt werden, dass die irreversibel gebundenen Vesikel an der Oberfläche intakt bleiben und nicht fusionieren. Es wurde ebenfalls deutlich, dass Annexin-Cluster an der Oberfläche die Vesikeladsorption vermitteln. Außerdem war ersichtlich, dass der N-Terminus von Annexin A1 bei der Membranaggregation erheblich beteiligt ist, da die Vesikeladsorption an membran-gebundenes delta1-29Annexin A1 vermindert ist. Durch Variation der Ladung der Vesikel und der Ionenstärke der Lösung konnte gezeigt werden, dass der Prozess der Vesikeladsorption teilweise elektrostatischen Charakter besitzt. Die Geschwindigkeitskonstanten der Vesikeladsorption, welche durch Computersimulationen ermittelt wurden, lagen jedoch um ein bis zwei Größenordnungen niedriger als die theoretisch für reine elektrostatische Interaktion berechneten, was auf eine Potentialbarriere zurückgeführt wurde, die in der Größenordnung von (5,0 +/- 1,5) kT liegt.
Schließlich wurde die Wechselwirkung von Annexin A1 mit seinem zellulären Liganden S100A11 untersucht und diese Interaktion in Zusammenhang mit den Membranbindungseigenschaften von Annexin A1 gebracht. Mittels Ligandenblots und Vesikelkopelletierungsassays konnte gezeigt werden, dass S100A11 Ca2+-abhängig mit Annexin A1 wechselwirkt, jedoch nicht an N-terminal verkürztes
delta1-29Annexin A1 bindet. Da S100A11 sowohl mit N-terminal acetyliertem Annexin A1ac, das aus Schweinelunge isoliert wurde, als auch mit bakteriell exprimiertem, nicht-acetyliertem Annexin A1n-ac wechselwirkt, konnte nachgewiesen werden, dass die N-terminale Acetylierung, wider dem Postulat aus der Literatur, nicht essentiell für die Wechselwirkung ist. Die Wechselwirkung stellte sich nicht als selektiv für Annexin A1 heraus, da auch eine Assoziation mit dem strukturell ähnlichem Annexin A2 detektiert wurde. Aus QCM-Messungen ist ersichtlich, dass weder S100A11 an membran-gebundenes Annexin A1, noch das strukturell ähnliche S100A10 an membran-gebundenes Annexin A2 bindet, da vermutlich die S100-Bindungsstelle durch die laterale Aggregation blockiert ist. Aufgrund der Ergebnisse wird für die Annexin A1-S100A11 Wechselwirkung postuliert, dass die Protein-Protein-Wechselwirkung nur in Lösung stattfindet und der Annexin A1-S100A11-Komplex eine niedrigere Affinität zu POPC/POPS (4:1)-Membranen aufweist als monomeres Annexin A1. Zudem stellte sich heraus, dass S100A11 die Kinetik der tryptischen Proteolyse des N-Terminus von Annexin A1 verlangsamt. So wird angenommen, dass S100A11 nicht nur die Membranbindung, sondern auch die Proteolyse reguliert und somit bei der Lokalisation von Annexin A1 eine Rolle spielt.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Annexin A1, like all annexins, binds to negatively charged phospholipids in a Ca2+-dependent manner and is also able to aggregate membranes. In this study it was possible to investigate the Annexin A1´s primary, Ca2+-dependent interaction to negatively charged, solid supported phospholipid membranes separated from the secondary membrane interaction. The interaction was visualised by means of ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Annexin A1, like all annexins, binds to negatively charged phospholipids in a Ca2+-dependent manner and is also able to aggregate membranes.
In this study it was possible to investigate the Annexin A1´s primary, Ca2+-dependent interaction to negatively charged, solid supported phospholipid membranes separated from the secondary membrane interaction. The interaction was visualised by means of scanning force microscopy (SFM) and quantified by the quartz crystal microbalance (QCM)-technique. Solid supported membranes, immobilised on the gold electrode of a 5 MHz quartz plate, were used, composed of a chemisorbed octanethiol (OT) monolayer and a second POPC/POPS (4:1)-phospholipid layer. QCM data reveal that annexin A1 adsorbs on POPC/POPS (4:1)-membranes in a Ca2+-dependent manner and desorbs after complexing the Ca2+-ions. The surface coverage after adsorption increases with increasing Ca2+-concentrations. Monitoring the adsorption and desorption in various different Ca2+-concentrations demonstrated that only part of the protein binds in a reversible fashion while most protein (60-80 %) binds irreversibly. Imaging POPC/POPS (4:1)-bilayers, immobilised on mica, after protein incubation by means of SFM, two-dimensional clusters of irreversibly bound Annexin A1 was visualised that varies in size and distribution. Based on these results a model for the Annexin A1-membrane interaction is proposed, where the protein adsorbs irreversibly on Ca2+-induced, PS-enriched domains in the membrane while it binds to the other part of the membrane in a reversible manner. Within this picture the rate constants of the different interaction modes were determined by means of computer simulations. Adsorption rates for the irreversible adsorption process konirr revealed to be one or two orders of magnitude larger than rate constants for the reversible adsorption kon. Increasing the Ca2+-concentrations resulted in a faster irreversible adsorption and higher affinity of the reversible interaction.
Binding studies of vesicles to annexin A1, bound to a solid supported membrane, were carried out to investigate the second membrane binding event separated from the first one. The dissipative quartz crystal microbalance-technique (QCM-D) allowed to not only quantify the amount of adsorbed vesicles but dissipation monitoring indicated that bound vesicles stay always intact on the surface and do not rupture. The vesicle adsorption process turned out to be fully irreversible and is mediated by two-dimensional annexin clusters. As the amount of bound vesicles to N-terminally truncated delta1-29Annexin A1 is significantly diminished, it is conducted that the N-terminus plays a crutial role in the membrane aggregation process. Supported by computer simulations, the results demonstrate that the vesicle adsorption process is in part electrostatically driven but compared to sole electrostatic binding the rate constants of adsorption are by one to two orders of magnitudes smaller indicating the presence of a potential barrier of about (5.0 +/- 1.5) kT.
Finally, the interaction of Annexin A1 with its cellular ligand S100A11 was investigated. By means of ligand blotting and vesicle assays it was shown that S100A11 interacts with Annexin A1 in a Ca2+-dependent manner, but not with N-terminally trucated delta1-29Annexin A1. In contrast to literature, the N-terminal acetylation of Annexin A1 turned out not to be essential for the interaction with S100A11. The selectivity of the interaction of Annexin A1 with S100A1 was rather poor, since binding was also observed between Annexin A2 and S100A11. QCM-measurements showed that neither S100A11 binds to membrane-bound Annexin A1, nor the structurally related S100A10 binds to membrane-bound Annexin A2. It is conducted that the S100-binding sites are blocked due to lateral aggregation of membrane-bound Annexin. Thus, it is proposed that S100A11 is only able to interact with Annexin A1 in solution and the Annexin A1-S100A11 complex exhibits a smaller affinity to POPC/POPS (4:1)-membranes than monomeric Annexin A1. Furthermore, it was shown that S100A11 reduces the kinetics of tryptic proteolysis of the Annexin A1´s N-terminus. Therefore, it is assumed that S100A11 does not only affect the membrane binding of Annexin A1 but also regulates proteolysis and consequently might be involved in the regulation of the cellular localisation of Annexin A1.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 13:08