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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-6792
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10449
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 2 August 2006 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Tag der Prüfung: | 26 Mai 2006 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmazeutische / Medizinische Chemie II (Prof. Buschauer) |
| Stichwörter / Keywords: | Neuropeptid Y , Nachweis , Durchflusscytometrie , Aequorin , Rezeptor , Neuropeptid Y , pharmakologische Assays , Durchflusszytometrie , Aequorin , neuropeptide Y , assays , flow cytometry , aequorin |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 10449 |
Zusammenfassung (Englisch)
For the discovery and pharmacological characterization of new ligands of G-protein coupled receptors, simple, robust and reliable assays are required. This thesis was aimed at the development of new binding and functional assays for the neuropeptide Y (NPY) receptor subtypes hY2, hY4 and rY4. CHO cells were stably transfected with the hY2 receptor gene and used in a flow cytometric binding ...
Zusammenfassung (Englisch)
For the discovery and pharmacological characterization of new ligands of G-protein coupled receptors, simple, robust and reliable assays are required. This thesis was aimed at the development of new binding and functional assays for the neuropeptide Y (NPY) receptor subtypes hY2, hY4 and rY4.
CHO cells were stably transfected with the hY2 receptor gene and used in a flow cytometric binding assay. Binding of unlabeled receptor ligands in competition with cy5-labeled pNPY was determined at equilibrium. Binding of the fluorescent ligand could be visualized by confocal microscopy. A radioligand binding assay was established and the determined binding constants were in good agreement with the ones obtained from the flow cytometric binding assay and with data from literature, respectively. The existence of a large fraction of spare receptors described in the literature was confirmed.
The Y2 receptor expressing cells were further stably transfected with the gene encoding the chimeric G-protein Gqi5, allowing the redirection of the signal transduction pathway towards the PLCβ, resulting in a large increase in intracellular calcium concentration after receptor activation. NPY receptor binding properties of the transfected cells remained unaffected. The calcium signal was quantitated in a flow cytometric and a spectrofluorimetric calcium assay. Functional data of agonists as well as antagonists were determined.
Additional stable transfection of the cells with the gene encoding for apoaequorin targeted to the mitochondrium converted the calcium mobilization into a luminescence signal. Assay parameters were optimized and an aequorin assay was established in the 96-well format of a luminescence plate reader. Functional data of selected peptides and nonpeptidic compounds were determined and compared with the fluorescence-based calcium assays. The calcium responses could be visualized by means of confocal microscopy and a CCD camera.
New fluorescent ligands for the Y4 receptor were synthesized by coupling the fluorescent dyes cy5 and S0586 to the peptide [K4]-hPP. A flow cytometric binding assay was established for the rat Y4 receptor using stably transfected CHO cells. Using a retroviral approach, the hY4 gene was transduced into P388-D1 cells. After enrichment of receptor expressing cells by sorting with the flow cytometer a cell clone with high receptor expression was isolated. Competition binding of known peptide ligands in the presence of the fluorescent ligands was measured by flow cytometry.
Furthermore, CHO cells were co-transfected with the hY4 (containing a Kozak sequence for enhanced protein translation), Gqi5 and mtAEQ (aequorin) gene. Stable cell clones were isolated and flow cytometric binding as well as fluorescence- and luminescence-based functional assays were established. It turned out that the peptide GW1229 behaved as a partial agonist in the spectrofluorimetric as well as in the aequorin assay. The calcium signal could be detected by confocal microscopy and by a CCD camera, indicating that the aequorin assay is applicable to HTS-instruments equipped with a CCD camera.
The screening of a small compound library revealed a small molecule with micromolar antagonistic activity at the hY4 receptor, which may be a starting point for the search for new Y4 receptor antagonists.
The main advantage of the established aequorin assay is the automation of the injection and recording process. Thereby, it is possible to perform more than 400 single calcium assays per day compared to about 40 assays performed with the spectrofluorimetric or flow cytometric calcium assay. Unlike the use of fluorescence dyes, after addition of the cofactor, washing steps are not required. Dye leakage is not an issue of the aequorin assay. The injection speed, which turned out to be an important parameter, is constant, and because the assay volume is very small (200 µl) costs are low and only small amounts of test compounds are required. The fact that the aequorin assay measures an event more distal in the GPCR signal transduction pathway seems not to affect the determined functional data.
Taken together, the established flow cytometric binding assays using fluorescence labeled ligands and stably transfected cells are an innovative alternative to radioligand binding assays. The principle of stable co-expression of receptor, chimeric G-protein and mitochondrially targeted aequorin gene for the development of functional fluorescence- and luminescence-based assays has proven to be an efficient approach. This methodology is transferable to other GPCRs, and will facilitate the search for new GPCR ligands as well as their functional characterization.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Für die Entdeckung und pharmakologische Charakterisierung neuer Liganden für G-Protein gekoppelte Rezeptoren werden einfache, robuste und zuverlässige Testsysteme benötigt. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuer Bindungs- und funktioneller Assays für die Neuropeptid Y (NPY) Rezeptoren hY2, hY4 und rY4. Zunächst wurden CHO Zellen stabil mit dem hY2 Rezeptorgen transfiziert und in einem ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Für die Entdeckung und pharmakologische Charakterisierung neuer Liganden für G-Protein gekoppelte Rezeptoren werden einfache, robuste und zuverlässige Testsysteme benötigt. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuer Bindungs- und funktioneller Assays für die Neuropeptid Y (NPY) Rezeptoren hY2, hY4 und rY4.
Zunächst wurden CHO Zellen stabil mit dem hY2 Rezeptorgen transfiziert und in einem durchflusszytometrischen Bindungsassay eingesetzt. Die Bindung von unmarkierten Rezeptorliganden in Gegenwart von cy5-markiertem pNPY wurde im Gleichgewicht bestimmt. Die durchflusszytometrisch ermittelten Bindungskonstanten stimmten mit den Werten aus einem ebenfalls etablierten Radioligandbindungsassay und mit Literaturwerten überein. Das Vorliegen einer in der Literatur beschriebenen Rezeptorreserve konnte bestätigt werden. Die Bindung des Fluoreszenzliganden konnte auch mittels konfokaler Mikroskopie nachgewiesen werden.
CHO Zellen wurden zusätzlich stabil mit einem Genkonstrukt, das für das chimäre G-Protein Gqi5 kodiert, transfiziert. Dieses bewirkt die Umleitung des Signaltransduktionsweges über PLCß und führt so zu einem starken Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration nach Rezeptoraktivierung. Die Bindungseigenschaften der transfizierten Zellen blieben unverändert, und das Calciumsignal wurde in einem durchflusszytometrischen und einem spektrofluorimetrischen Calciumassay quantifiziert. Funktionelle Daten von Agonisten und Antagonisten wurden ermittelt.
Durch weitere stabile Transfektion der Zellen mit dem Genkonstrukt für mitochondrial exprimiertes Apoaequorin gelang es, die intrazelluläre Calciummobilisierung als Lumineszenzsignal zu messen. Nach Optimierung der Versuchsparameter wurde ein Aequorinassay im 96-well-Format entwickelt. Damit wurden funktionelle Daten von Peptiden und nichtpeptidischen Substanzen mit einem Plattenleser bestimmt und mit den Ergebnissen der fluoreszenzbasierten Calciumassays verglichen. Die Calciumsignale konnten ebenfalls mittels konfokaler Mikroskopie und mittels CCD Kamera detektiert werden.
Durch Kopplung der Fluoreszenzfarbstoffe cy5 und S0586 an das Peptid [K4]-hPP wurden neue Fluoreszenzliganden für den Y4 Rezeptor synthetisiert. Unter Verwendung stabil transfizierter CHO Zellen wurde ein duchflusszytometrischer Bindungsassay für den rY4 Rezeptor etabliert.
Außerdem gelang es, mittels Retroviren das hY4 Rezeptorgen in P388-D1 Zellen zu transduzieren und nach Sortierung der rezeptorexprimierenden Zellen mit dem Durchflusszytometer einen Zellklon mit hoher Rezeptorexpression zu isolieren. Die durchflusszytometrisch bestimmte Verdrängung der Fluoreszenzliganden lieferte für bekannte Peptidliganden mit konventionell bestimmten Daten vergleichbare Ergebnisse.
Weiterhin wurden CHO Zellen mit den Genkonstrukten hY4 (mit integrierter Kozaksequenz), Gqi5 und mtAEQ cotransfiziert. Stabile Zellklone wurden isoliert und durchflusszytometrische Bindungsassays, sowie fluoreszenz- und lumineszenzbasierte funktionelle Assays etabliert. Das Peptid GW1229 verhielt sich als partieller Agonist sowohl im spektrofluorimetrischen als auch im Aequorinassay. Das Calciumsignal konnte wiederum auch mittels konfokaler Mikroskopie und CCD Kamera visualisiert bzw. quantifiziert werden.
Das Screening einer kleinen Substanzbibliothek führte zu einer niedermolekularen Substanz mit mikromolarer antagonistischer Aktivität - einer möglichen Leitstruktur für die Suche nach weiteren Y4 Rezeptorantagonisten.
Der Hauptvorteil des etablierten Aequorinassays liegt in der Automatisierung von Injektion und Detektion. Auf diese Weise ist die Durchführung von über 400 Einzelmessungen pro Tag möglich, verglichen mit etwa 40 Einzelmessungen mit dem spektrofluorimetrischen oder durchflußzytometrischen Calciumassay. Im Gegensatz zur Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen sind keine Waschschritte notwendig, es kommt auch nicht zum Auslaufen des Farbstoffes aus den Zellen. Die Injektionsgeschwindigkeit, die sich als wichtiger Parameter erwies, ist konstant, aufgrund des geringen Probenvolumens (200 µl) sind die Kosten gering, und es werden nur kleine Mengen der Testsubstanzen benötigt. Auch wenn die Reaktion des Reporterproteins Aequorin ein sehr spätes Ereignis des Signaltransduktionsweges widerspiegelt, wird die Ermittlung der funktionellen Daten dadurch nicht beeinträchtigt.
Die etablierten durchflusszytometrischen Bindungsassays unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Liganden und stabil transfizierter Zellen stellen eine innovative Alternative zu Radioligandbindungsassays dar. Das Prinzip der stabilen Co-Expression von Rezeptor, chimärem G-Protein und mitochondrial exprimiertem Apoaequorin erweist sich als geeignete Vorgehensweise für die Entwicklung funktioneller fluoreszenz- und lumineszenzbasierter Assays. Diese Vorgehensweise ist auf andere GPCRs übertragbar und wird die Suche nach neuen GPCR-Liganden und deren funktionelle Charakterisierung erleichtern.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 12:57
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