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Die Rolle von CpG-Dinukleotiden bei der Regulation der Transgenexpression am Beispiel verschiedener Reportergene

URN to cite this document: urn:nbn:de:bvb:355-opus-6964

Leikam, Doris (2006) Die Rolle von CpG-Dinukleotiden bei der Regulation der Transgenexpression am Beispiel verschiedener Reportergene. PhD, Universität Regensburg

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Abstract (German)

DNA-basierte therapeutische Strategien wie z. B. DNA-Vakzinierung oder Gentherapie werden häufig durch ein Silencen der Antigenexpression nachhaltig beeinträchtigt, da der rekombinante Wirkstoff nachfolgend nicht mehr in physiologisch ausreichender Konzentration vorliegt. So ist bekannt, dass die Methylierung von CpG-Dinukleotiden in promotornahen Bereichen einen epigenetischen Regulationsmechanismus darstellt, der in vielen Fällen zu einem Abschalten der Genexpression führt. CpG-freie Genvarianten sollten folglich vor Methylierung und einer damit verbundenen Repression der Transkription geschützt sein. Anders als erwartet wurde in dieser Arbeit für eine CpG-freie Version verschiedener Transgene in vitro jedoch eine schwächere Expressionsleistung als für das CpG-haltige Ausgangskonstrukt detektiert. Darüber hinaus erreichte ein CpG-maximiertes Reportergen gegenüber dem Ausgangskonstrukt eine gesteigerte Proteinexpression. Dieser positive Zusammenhang von CpG-Gehalt im Transgen und resultierender Reporteraktivität manifestierte sich auch auf RNA-Ebene. Dabei konnte eine für das CpG-depletierte Konstrukt beobachtete Verringerung transgenspezifischer RNA-Transkripte weder auf differentielle Kernexportraten noch auf RNA-Instabilität oder das Vorliegen alternativer Spleissprodukte zurückgeführt werden. Vielmehr wurde im Verlauf der Arbeit nachgewiesen, dass sich CpG-freie Transgene bereits durch geringere Mengen de novo synthetisierter RNA-Transkripte auszeichnen. Das beschriebene CpG-Phänomen wurde somit für virale sowie nicht-virale Transgene unabhängig von Zelltyp und Expressionsdauer nachgewiesen, was einen generellen Mechanismus der CpG-basierten Genaktivierung auf transkriptioneller Ebene impliziert. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit eine partiell CpG-reduzierte Vektorplattform mit modularem Aufbau etabliert. In transienten sowie in stabilen Expressionsexperimenten zeigte sich für die CpG-reduzierten Plasmide im Vergleich zu den CpG-haltigen Referenzkonstrukten eine erhöhte Expressionsleistung. Somit stellt die Modifizierung des CpG-Gehaltes in Vektorrückgrat und Transgen einen Ansatzpunkt zur Verbesserung der Expressionseffizienz dar. Folglich sollte diese Strategie bei der rationalen Konzeption DNA-basierter Therapeutika sowie der effektiven Produktion rekombinanter Proteine in Säugerzellen in Betracht gezogen werden.

Translation of the abstract (English)

Different plasmid DNA applications like DNA vaccination or gene therapy are hampered by silencing of gene expression, often triggered by epigenetic control mechanisms such as methylation of CpG dinucleotides. The impact of CpG dinucleotide content on transgene expression efficiency, however, is still controversially dicussed within the scientific society. Therefore, this study aimed to determine the contribution of intragenic CpG content on transgene expression efficiency in transiently and stably transfected mammalian cells. Based upon a humanized version of green fluorescent protein, containing 60 CpGs within its coding sequence, a novel CpG-depleted gfp reporter variant was established without altering the amino acid sequence. Within stable Flp-In cell lines the individual expression levels of both reporter constructs remained constant for a period of more than 56 weeks, however, at different levels. Interestingly, for the CpG-depleted GFP gene reporter activitiy - measured as mean fluorescence intensity value - was reduced 6-9 fold for Flp-In CHO cells and 10-20 fold for Flp-In 293T cells, respectively. This reduction of reporter function could be correlated with diminished protein levels and mRNA copy numbers that were reduced 7-fold for Flp-In CHO and 29-fold for Flp-In 293T cells after the removal of CpGs. Moreover, we could demonstrate that decreased mRNA levels were not due to nuclear export restrictions, alternative splicing, or mRNA instability but rather resulted from significantly diminished de novo transcriptional activity. This CpG effect was observed irrespective of cell-type and expression system and thus implies a common transcription-based mechanism of gene regulation via CpGs. Moreover, a partially CpG-reduced vector platform composed of modular elements was established. In stable and transient expression analyses the use of CpG-reduced vector constructs led to increased expression efficiency compared to the CpG containing reference vectors. Accordingly, modifying the CpG content within vector backbone and coding region represents an initial point for increasing transgene expression efficiency. Therefore, this strategy should be considered for the rational conception of DNA-based therapeutics and the effective production of recombinant proteins in mammalian cells.

Item Type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Referee:	Hans Robert (Prof. Dr. Dr.) Kalbitzer
Date of exam:	26 July 2006
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer
Keywords:	Methylierung , CpG-Inseln , Grün fluoreszierendes Protein , Genexpression , Heterologe Genexpression , Genregulation , Gentherapie , Gentransfer , CpG-Dinukleotide , Silencen , CpG-Motive , Langzeitexpression , CpG-reduzierter Vektor , CpG dinucleotides , CpG motive , silencing , long-term expression , CpG-reduced vector
Subjects:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Owner:	Universitätsbibliothek Regensburg
Deposited On:	27 Oct 2009 08:49
Last Modified:	16 Oct 2012 14:41
Item ID:	10464

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