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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-7390
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10482
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
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Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 28 November 2006 |
Begutachter (Erstgutachter): | Hans-Helmut (Prof. Dr.) Kohler |
Tag der Prüfung: | 7 November 2006 |
Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik |
Stichwörter / Keywords: | Polyelektrolyt , Diffusionskoeffizient , Konzentration , Gradientenverfahren , Proteine , Fluoreszenzmarkierte Verbindungen , Boltzmann-Gradientenmethode , fluorescence labeled protein , Boltzmann gradient method , diffusion cell |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 10482 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Der konzentrationsabhängige Diffusionskoeffizient eines Polyelektrolytions in salzarmer Lösung (Salzkonzentration: 1 mmol/l) wird aus nur einem dynamischen Gradientenexperiment bestimmt. Die Berechnung des Diffusionskoeffizienten erfolgt nach der Boltzmann-Methode (L. Boltzmann, Ann. Physik, 53, 959 (1894)). Die Tiefe der Diffusionszelle beträgt zur Reduzierung von Abbildungsfehlern bei der ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Der konzentrationsabhängige Diffusionskoeffizient eines Polyelektrolytions in salzarmer Lösung (Salzkonzentration: 1 mmol/l) wird aus nur einem dynamischen Gradientenexperiment bestimmt. Die Berechnung des Diffusionskoeffizienten erfolgt nach der Boltzmann-Methode (L. Boltzmann, Ann. Physik, 53, 959 (1894)). Die Tiefe der Diffusionszelle beträgt zur Reduzierung von Abbildungsfehlern bei der optischen Bestimmung der Polyelektrolytkonzentration lediglich 0.4 mm. Für das Experiment wird eine Lösung fluoreszenzmarkierter Proteine (Rinder-Serumalbumin: BSA), deren Konzentration 4 g/l beträgt, mit einer proteinfreien Lösung gleichen Salzgehalts und gleichen pH-Werts (6.5) überschichtet. Die Markierung mit einem Alexafarbstoff (im Handel mit einem Markierungsgrad von 6 pro Protein erhältlich) dient der Sichtbarmachung auch sehr kleiner Proteinkonzentrationen. Der Lösungsraum wird mit einer LED belichtet und das resultierende Fluoreszenzintensitätsprofil mit einer CCD-Kamera gemessen. Die Fluoreszenzintensität ist proportional zur Polyelektrolytkonzentration. Markierungsbedingt wird die Nettoladungszahl des Proteins bei den genannten Lösungseigenschaften eigenen Berechnungen zufolge von � 5 auf � 18 verändert. Im Vordergrund der Arbeit steht der Grenzbereich starker Verdünnung, dem bisher wenig Beachtung geschenkt wurde. Meist wird eine lineare Konzentrationsabhängigkeit des Diffusionskoeffizienten bis in den Grenzbereich starker Verdünnung angenommen. Die eigenen Experimente bei 5 °C und 17 °C ergeben dagegen eine Konstanz des Diffusionskoeffizienten ausgehend von der stark verdünnten Lösung bis zu einer Grenzkonzentration von ca. 1.5 g/l. Dieser Befund wird durch kürzlich veröffentlichte Lichtstreuexperimente bestätigt. Eine Erklärung für dieses Verhalten wird gegeben. Die eigenen Werte für den Diffusionskoeffizienten im Grenzbereich starker Verdünnung fügen sich gut in die Literaturwerte ein. Die Walden-Regel ist erfüllt. Oberhalb der Grenzkonzentration nimmt der Diffusionskoeffizient genähert linear zu. Ab einer Konzentration von etwa 3.4 g/l strebt er einem konstanten Wert zu. Die Ursache für das Sättigungsverhalten ist nicht bekannt. Die verallgemeinerte Stokes-Einstein Gleichung wird zur Erklärung der Konzentrationsabhängigkeit des Diffusionskoeffizienten genutzt. Der Reibungskoeffizient des Polyelektrolytions wird als konzentrationsunabhängig angenommen, die osmotische Kompressibilität wird aus dem Quasi-Gleichgewicht der Salzionen (Donnan-Gleichgewicht) berechnet. Wir nehmen eine effektive Ladung des Proteins an. Die erhaltenen Gleichungen für den Diffusionskoeffizienten ermöglichen die Bestimmung der effektiven Nettoladungszahl aus dem linearen Abhängigkeitsbereich. Der berechnete Wert ist in beiden Experimenten ca. � 6 und damit betragsmäßig deutlich kleiner als � 18, die berechnete Nettoladungszahl des markierten Proteins (Effekt der Gegenionenkondensation). Seit kurzem ist es möglich Proteine unter Ladungserhaltung mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren. Dadurch kann das in dieser Arbeit vorgestellte Verfahren den Diffusionskoeffizienten des nativen Proteins liefern. Ein besonders interessantes Anwendungsgebiet der Gradientenmethode wäre der Bereich großer Polyelektrolytkonzentration (z. B. BSA-Konzentration größer als 100 g/l), da er Lichtstreuexperimenten wegen der Trübheit der Lösungen nicht zugänglich ist. Es existieren bereits Prognosen für den Diffusionskoeffizienten in diesem Bereich, die durch unsere Methode überprüft werden könnten.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The concentration dependence of a polyelectrolyte diffusion coefficient in a low salt solution (salt concentration: 1 mmol/l) is determined by a single dynamic gradient experiment. To calculate the diffusion coefficient the Boltzmann method (L. Boltzmann, Ann. Physik, 53, 959 (1894)) is used. The diffusion cell has a deepness of only 0.4 mm to reduce aberration in the optical detection of ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The concentration dependence of a polyelectrolyte diffusion coefficient in a low salt solution (salt concentration: 1 mmol/l) is determined by a single dynamic gradient experiment. To calculate the diffusion coefficient the Boltzmann method (L. Boltzmann, Ann. Physik, 53, 959 (1894)) is used. The diffusion cell has a deepness of only 0.4 mm to reduce aberration in the optical detection of polyelectrolyte concentration. In the experiment a protein-free salt solution is carefully layered above a solution of a fluorescence labeled protein (bovine serum albumin, BSA of concentration 4 g/l) of the same salt concentration and the same pH (6.5). BSA is labeled by an alexa-dye (commercially available with 6 alexa-dyes per protein) for better detection in the regime of very small polyelectrolyte concentration. The cell is exposed to a LED and the resulting fluorescence intensity profile detected by a CCD-camera. The fluorescence intensity is proportional to the polyelectrolyte concentration. Calculations show that, due to labeling, the net charge of BSA changes from � 5 to � 18 in solutions specified above. The focus of the work is on the very dilute regime, where little information is available yet. A linear concentration dependence of the diffusion coefficient is mostly assumed in the very dilute regime. Our experiments at 5 °C and 17 °C, however, show that the diffusion coefficient remains constant at very low concentrations until a threshold of about 1.5 g/l is reached. This result is confirmed by dynamic light scattering experiments published recently. An explanation for this behaviour is given. The measured values for the diffusion coefficient in very dilute solutions are in good agreement with literature values. The Walden rule is obeyed. Above the threshold concentration the concentration dependence of the diffusion coefficient is approximately linear. Above a concentration of about 3.4 g/l the diffusion coefficient seems to approach a constant value. The reason for the saturation behaviour is unknown. A generalized Stokes-Einstein equation is used to explain the concentration dependence of the diffusion coefficient. The friction coefficient of the polyion is assumed to be concentration-independent. The osmotic compressibility is calculated from a quasi-equilibrium (Donnan-equilibrium) for the salt ions. We assume an effective net charge of the polyion. The resulting equations for the diffusion coefficient allow us to determine the effective net charge of labeled BSA from the linear section of the diffusion coefficient versus concentration dependence. In both experiments its value is about � 6, which is distinctly smaller in absolute value than � 18, the net charge of labeled BSA (effect of counterion condensation). Recently fluorescence-dyes have been developed that do not change the native charge of a protein. Therefore, the method presented in this work can be used to determine the diffusion coefficient of a native protein. The application of the gradient method to determine the diffusion coefficient in the high concentration regime (i. e. BSA concentration greater than 100 g/l) seems very interesting. Due to the opacity of the solution dynamic light scattering cannot be used in this concentration regime. Estimations in this regime could be tested by our method.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 12:53