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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-112121
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 2 September 2009 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Roland Seifert und Prof. Dr. Susanne Grässel und Prof. Dr. Achim Göpferich |
| Tag der Prüfung: | 27 November 2009 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmakologie und Toxikologie (Prof. Schlossmann, ehemals Prof. Seifert) |
| Stichwörter / Keywords: | Morbus Chron , Kollagen XVI , Myofibroblasten , Integrin , Fibrillin-1 , Fokale Kontakte , Entzündung |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 11212 |
Zusammenfassung (Englisch)
Molecular interactions of collagen XVI in Crohn’s disease In Crohn’s disease (CD) the stress-shield of intestinal subepithelial myofibroblasts (ISEMF), provided by intact tissue is disturbed due to inflammation and cells start with remodelling activities. This is characterized by increased numbers of collagen-producing ISEMF causing an uncontrolled, irreversible wound-healing response to the ...
Zusammenfassung (Englisch)
Molecular interactions of collagen XVI in Crohn’s disease
In Crohn’s disease (CD) the stress-shield of intestinal subepithelial myofibroblasts (ISEMF), provided by intact tissue is disturbed due to inflammation and cells start with remodelling activities. This is characterized by increased numbers of collagen-producing ISEMF causing an uncontrolled, irreversible wound-healing response to the chronic inflammation of the gastrointestinal tract. Reconstitution of the original extracellular matrix (ECM) leads ISEMF to exit this cycle, however, in fibrosis ISEMF remain. It is known that ISEMF produce and deposit collagen types I, III, IV and V; but synthesis and the role of fibrillar peripheral molecules like collagen type XVI have not been addressed yet. Here, we have analyzed distribution of collagen XVI in the normal and inflamed bowel wall, its gene and protein expression by ISEMF of different inflammation stages, the cell-matrix interactions in different phases of the inflammatory process and the effect of collagen XVI on cell proliferation and migration. Collagen XVI is deposited in the submucosa of the intestinal wall and ISEMF reveal increasing gene and protein expression of collagen XVI with concurrent increasing inflammation. ISEMF display more mature focal adhesion contacts when seeded on collagen XVI resulting in an extensive cell spreading. This might involve recruitment of α1 integrin, since its cell surface expression on ISEMF is increased in late stages of inflammation. We assume that collagen XVI promotes persistence of ISEMF in the normal and even stronger in the inflamed bowel wall by stabilizing focal adhesion contacts via cell-matrix interaction preferentially through recruitment of α1ß1 integrin into the focal contacts.
Mechanistical studies of collagen XVI by a retroviral mediated knockdown model in murine fibroblasts
Collagen XVI, a member of FACIT collagens (fibril associated collagens with interrupted triple helices) is described as macro-molecule of the ECM. Very little is known about its role in cell-matrix-interactions and in cell signalling. However it has been demonstrated that cells interact with collagen XVI via integrin α1β1 and α2β1. These interactions presumably determine organization of extracellular components and their communication with cells. We have established a retroviral mediated collagen XVI knockdown in NIH3T3 fibroblasts to investigate the role of collagen XVI in cell-matrix interactions. Specific shRNAs against collagen XVI were utilized in parallel to a viral luciferase vector construct as control. After successful transduction, positive cell clones were further selected by antibiotic resistance. Knockdown efficiency was determined on mRNA and protein level and further downstream experiments were performed with respect to adhesion and proliferation. Differential protein expression in knockdown cells was compared to the control by 2D-gelelectrophoresis.
The knockdown resulted in 80-90 % inhibition of collagen XVI gene and protein expression and mass spectrometry revealed several differentially expressed proteins. Collagen XVI inhibited cell lysates showed a lack of macrophage migration inhibitory factor (MIF) and prolylpeptidyl-cis-trans-isomerase A (PPIA). The gene expression of these proteins was slightly up-regulated, however, western blot analysis confirmed 2D-gelelectrophoresis results. Proliferation of knockdown cells was generally reduced and was not influenced by the presence of collagen XVI as cell culture substrate. The cytokine MIF influences migration and proliferation of fibroblasts during wound healing. MIF induces synthesis of collagens in fibroblasts (collagen I, III, IV, V and VI) whereas PPIA contributes to correct protein folding in the cytoplasm of cells. Collagen XVI acts as adapter molecule in organizing suprastructures. Therefore, we assume that the lack of collagen XVI detains fibroblasts in arranging fibrillar stuctures which results in disturbed initial adhesion. The amelioration of cellular adhesion to the available matrix indicates a compensation in integrin expression pattern. Reduced proliferation together with decreased MIF expression hints at changes in the differentiation stage and has to be further elucidated.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Molekulare Interaktionen von Kollagen XVI in Morbus Crohn Intaktes Gewebe repräsentiert ein Schutzschild für die darin befindlichen Zellen. In Morbus Crohn ist dieser Schutzschild durch die chronische Entzündung gestört und Zellen, allen voran, intestinale subepitheliale Myofibroblasten (ISEMF) beginnen mit Reparaturarbeiten. Die Zahl der Kollagen-produzierenden ISEMF steigt als Reaktion auf die ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Molekulare Interaktionen von Kollagen XVI in Morbus Crohn
Intaktes Gewebe repräsentiert ein Schutzschild für die darin befindlichen Zellen. In Morbus Crohn ist dieser Schutzschild durch die chronische Entzündung gestört und Zellen, allen voran, intestinale subepitheliale Myofibroblasten (ISEMF) beginnen mit Reparaturarbeiten. Die Zahl der Kollagen-produzierenden ISEMF steigt als Reaktion auf die Entzündung im Gastrointestinaltrakt an und verursacht eine unkontrollierte, irreversible Wundheilung. Die Wiederherstellung der ursprünglichen extrazellulären Matrix (ECM) leitet das Absterben der Zellen ein, in fibrotischem Gewebe jedoch bleiben ISEMF vor Ort und bilden weiter Kollagen I, III, IV und V. Die Expression von Molekülen, die diese Kollagene quer-vernetzen können, wie z.B. Kollagen XVI wurde bisher nicht untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde die Verteilung von Kollagen XVI in der gesunden und erkrankten Darmwand, sowie die Gen- und Proteinexpression durch ISEMF unterschiedlicher Entzündungszustände untersucht. Außerdem wurden Zell-Matrix Interaktionen in verschiedenen Phasen des Entzündungsprozesses und der Effekt von Kollagen XVI auf Zellproliferation und –migration analysiert. Kollagen XVI wird in allen Darmschichten abgelagert und ISEMF zeigen steigende Gen- und Proteinexpression von Kollagen XVI mit zunehmender Entzündung.
ISEMF weisen mehr und reifere fokale Kontakte auf, wenn sie auf Kollagen XVI kultiviert werden und breiten sich besser aus. Dieser Prozess involviert α1 Integrin, dessen Expression an der Zelloberfläche in späten Phasen der Entzündung erhöht ist. Wir vermuten, dass Kollagen XVI das Verbleiben von ISEMF in der gesunden Darmwand begünstigt und noch stärker in der entzündeten Darmwand. Dies geschieht durch die Stabilisierung fokaler Kontakte durch α1ß1 Integrin vermittelte Zell-Matrix Interaktionen.
Funktionelle Studien von Kollagen XVI anhand eines retroviral vermittelten Knockdown Modells in murinen Fibroblasten
Kollagen XVI, ein Mitglied der Familie der FACIT Kollagene (fibril associated collagens with interrupted triple helices) gehört zu den Makro-Molekülen in der ECM. Es ist noch wenig über die Rolle in Zell-Matrix Interaktionen und Zell-Signalwegen die Kollagen XVI involvieren bekannt. Bisher wurde gezeigt, dass Kollagen XVI über α1β1 and α2β1 Integrine mit Zellen interagieren kann. Diese Wechselwirkungen bestimmen vermutlich die Organisation der extrazellulären Komponenten und deren Kommunikation mit Zellen. Wir haben ein Knockdown Modell in NIH3T3 Fibroblasten etabliert um die Rolle von Kollagen XVI in Zell-Matrix-Interaktionen zu analysieren. Spezifische shRNAs gegen Kollagen XVI wurden parallel zu einem Luciferase Vektor Konstrukt als Kontrolle verwendet. Nach einer erfolgreichen Transduktion wurden positive Zellklone durch eine Antibiotika Resistenz isoliert und weiter kultiviert. Die Knockdown Effizienz wurde auf mRNA- und Proteinebene bestimmt und weiterführende Experimente wurden in Bezug auf Adhäsion und Proliferation durchgeführt. Differentiell exprimierte Proteine wurden in der 2D-Gelelektrophorese dargestellt. Der Knockdown resultierte in 80-90% Inhibition von Kollagen XVI Gen- und Proteinexpression und die Massenspektrometrie zeigte in Kollagen XVI Knockdownzellen einen Verlust von Makrophagen Migrations Inhibitor Faktor (MIF) und Prolylpeptidyl-cis-trans-isomerase A (PPIA). Die Genexpression war leicht hoch-reguliert, Westernblot Analysen bestätigten jedoch die Ergebnisse der 2D-Gelelektrophorese. Die Proliferation der Knockdown Zellen war allgemein reduziert und nicht beeinflusst durch die Anwesenheit von Kollagen XVI als Zellkultursubstrat. Das Zytokin MIF beeinflusst die Migration und Proliferation von Fibroblasten während der Wundheilung und induziert die Produktion von Kollagenen während PPIA an der korrekten Proteinfaltung im Zytoplasma beteiligt ist. Kollagen XVI wirkt als Adaptermolekül in der Organisation von Suprastrukturen. Darum denken wir, dass ein Mangel an Kollagen XVI Fibroblasten in der Reorganisation von fibrillären Strukturen und damit der initialen Adhäsion behindert. Die Verbesserung der zellulären Adhäsion auf verfügbarer Matrix weist auf eine Kompensation im Integrinexpressionsmuster hin. Reduzierte Proliferation zusammen mit einem Verlust in MIF Expression indiziert Veränderungen im Differenzierungstatus und muss weiter untersucht werden.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 15:08
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