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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-127746
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 16 Februar 2011 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Tag der Prüfung: | 4 Februar 2010 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie |
| Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | allosterische Kontrolle, Ammoniakkanal, Histidin Biosynthese, Tryptophan Biosynthese, allosteric mechanism, ammonia chanel, histidine biosynthesis, tryptophan biosynthesis |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 12774 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Struktur, Funktion und Evolution von Glutaminamidotransferasen (GATasen). Vertreter dieser Enzymfamilie sind für den Einbau von Stickstoff innerhalb der Biosynthesewege von Nukleotiden, Aminosäuren, Coenzymen und Antibiotika verantwortlich. Bei allen GATasen wird am aktiven Zentrum einer Glutaminase durch die Hydrolyse von Glutamin Ammoniak ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Struktur, Funktion und Evolution von Glutaminamidotransferasen (GATasen). Vertreter dieser Enzymfamilie sind für den Einbau von Stickstoff innerhalb der Biosynthesewege von Nukleotiden, Aminosäuren, Coenzymen und Antibiotika verantwortlich. Bei allen GATasen wird am aktiven Zentrum einer Glutaminase durch die Hydrolyse von Glutamin Ammoniak erzeugt, der durch einen vom Lösungsmittel abgeschirmten Kanal zum aktiven Zentrum der Synthase gelangt und mit dem dort gebundenen Substrat zu einem oder mehreren Produkten reagiert. In der Regel wird die Glutaminase erst durch die Bindung des Substrates an die Synthase aktiviert, wodurch die verschwenderische Hydrolyse von Glutamin verhindert wird.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde hauptsächlich die GATase Imidazolglycerinphosphat-Synthase (ImGPS, 1:1 Komplex aus der Glutaminase HisH und der Synthase HisF) aus der Histidin-Biosynthese von Thermotoga maritima charakterisiert. In einem Seitenprojekt wurde die Anthranilat-Synthase (AS, 2:2 Komplex aus der Glutaminase TrpG und der Synthase TrpE) aus der Tryptophan-Biosynthese von T. maritima vergleichend untersucht. HisH und TrpG gehören zur Klasse I der Glutaminasen, die als typisches Merkmal eine katalytische Triade (Cys-His-Glu) besitzen, während HisF und TrpE keine strukturellen oder funktionellen Ähnlichkeiten aufweisen.
Der Hauptteil der Arbeit beschäftigte sich mit der strukturellen Grundlage der Kopplung von Glutaminase- und Synthaseaktivität im HisH:HisF-Komplex. Die Bindung des HisF-Substrates N‘-[5’phosphoribulosylformimino]-5-aminoimidazol-4-carboxamid-Ribonucleotid (PRFAR) führt zur Hydrolyse von Glutamin am 25 Ǻ entfernt liegenden aktiven Zentrum von HisH. Dort entstandener Ammoniak gelangt durch einen langen Kanal zum aktiven Zentrum von HisF, wo er mit PRFAR zu den Produkten ImGP und 5‘-Aminoimidazol-4-carboxamid-Ribonucleotid (AICAR) reagiert. Als aktivierende Liganden können neben dem Substrat auch das Analogon ProFAR, ImGP und, wie sich im Laufe der Arbeit herausstellte, NAD+ dienen. Zur Identifizierung von Resten, die an der Regulation der Glutaminaseaktivität von HisH beteiligt sind, wurden an der Kontaktfläche der beiden Untereinheiten eine Reihe von Aminosäuren zu Alanin mutiert und die Konsequenzen der Austausche für die Funktion und Struktur der ImGPS untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, dass Asp98 aus HisF entscheidend zur Glutaminaseaktivität von HisH beiträgt. Vermutlich bildet die Carboxylatseitenkette dieses Restes eine Wasser-vermittelte Interaktion mit His178 aus der katalytischen Triade von HisH aus und vervollständigt auf diese Weise das aktive Zentrum der Glutaminase. Es scheint, dass diese aktivierende Interaktion nur in Anwesenheit eines HisF-Liganden vollständig ausgeprägt ist.
Die Reste Tyr138 und Lys181 aus HisH flankieren die katalytische Triade und grenzen sie an der Kontaktfläche zu HisF vom Lösungsmittel ab. Die beiden Einzelmutationen Y138A und K181A führten zu gesteigerter Glutaminaseaktivität in Anwesenheit eines HisF-Liganden wie auch zu konstitutiver, d.h. zu Liganden-unabhängiger Glutaminhydrolyse. Die Kombination der beiden Mutationen steigerte die konstitutive Glutaminaseaktivität der ImGPS im Vergleich zum wildtypischen Enzym um den Faktor 4400, wobei nur noch 5 % des gebildeten Ammoniaks mit PRFAR abreagierten. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung zeigte die Röntgenstruktur der Doppelmutante, dass durch das Entfernen der beiden voluminösen Seitenketten ein Zugang zum Lösungsmittel entsteht, durch den naszierender Ammoniak abdiffundieren kann (Kooperation mir Dr. Matthias Wilmanns, EMBL Hamburg). Auf der Basis dieser Beobachtung wird ein neuartiges Modell zur Aktivierung der Glutaminase diskutiert, das auf durch naszierenden Ammoniak verursachte Produktinhibition beruht, die entweder durch dessen Reaktion mit PRFAR oder durch seine Diffusion ins Lösungsmittel aufgehoben werden kann.
In früheren Arbeiten war postuliert worden, dass der am aktiven Zentrum von HisF gelegene flexible Loop β1α1 (Loop1) den Ausgangspunkt für die Aktivierung von HisH darstellen könnte. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die enzymatische Aktivität der HisF-Loop1 Mutante untersucht und ihre Röntgenstruktur aufgeklärt (Kooperation mir Dr. Matthias Wilmanns, EMBL Hamburg). Die Ergebnisse erbrachten keine eindeutigen Hinweise für die die Rolle von Loop1 bei der Signaltransduktion, machen seine Beteiligung an der Bindung von PRFAR jedoch unwahrscheinlich.
Um durch HisF-Liganden induzierte Konformationsänderungen mit aktivierender Wirkung auf HisH zu identifizieren, müssen die Strukturen der apo- und der holo-Form der ImGPS verglichen werden. Bisher ist es jedoch nicht gelungen, eine Röntgenstruktur der ImGPS mit gebundenem Synthase-Liganden aufzuklären. Um diesbezügliche Informationen zu erhalten, wurden NMR-Titrationsexperimente mit isotopenmarkiertem HisF durchgeführt. Die Ergebnisse deuten auf weitreichende ligandinduzierte Konformationsänderungen hin, deren funktionelle Bedeutung jedoch momentan noch unklar ist (Kooperation mit Prof. Eike Brunner, Universität Regensburg und TU Dresden).
Um die Reaktions- und Aktivierungsmechanismen verwandter Glutaminasen vergleichend zu untersuchen, wurden TrpG-Mutanten genauer charakterisiert, die auch in Abwesenheit der Synthase TrpE konstitutiv Glutamin hydrolysieren. Dabei wurden bereits vorhandene und neu hergestellte Mutanten enzymkinetisch und durch Moleküldynamik-Simulationen analysiert (Kooperation mir Dr. Marco Bocola, Universität Regensburg). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Mutationen zu Umlagerungen am aktiven Zentrum von TrpG führen, die eine Aktivierung der katalytischen Triade zur Folge haben. Dies lässt vermuten, dass in HisH und TrpG unterschiedliche Effekte zu konstitutiver Aktivität führen und sich wohl auch die Aktivierungsmechanismen durch die Synthasen HisF und TrpE grundlegend unterscheiden.
Im letzten Teil der Arbeit wurde die evolutive Verwandtschaft von TrpG und HisH näher untersucht. Dem Ansatz lag die Annahme zugrunde, dass sich beide Glutaminasen aus einem gemeinsamen Vorläufer entwickelten, der sowohl mit HisF als auch mit TrpE produktive Komplexe bilden konnte. Um die Plausibilität dieser Annahme zu überprüfen, wurde versucht, die Kontaktfläche von HisH auf TrpG zu übertragen und dadurch einen stabilen TrpG:HisF Komplex zu etablieren. Obwohl insgesamt bis zu 92 % der Kontaktfläche von TrpG ausgetauscht wurden, ergaben sich weder in vivo (yeast-two-hybrid) noch in vitro (Gelfiltration, Fluoreszenztitration) Hinweise auf eine Interaktion mit HisF.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The bi-enzyme complex imidazole glycerol phosphate synthase (ImGP-S) belongs to the family of glutamine amidotransferases (GATases). GATases exert a key role in nitrogen incorporation into numerous metabolic intermediates. ImGP-S consists of a synthase and a glutaminase subunit. The ImGP glutaminase HisH generates ammonia by hydrolyzing glutamine, which reacts at the active site of the synthase ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The bi-enzyme complex imidazole glycerol phosphate synthase (ImGP-S) belongs to the family of glutamine amidotransferases (GATases). GATases exert a key role in nitrogen incorporation into numerous metabolic intermediates. ImGP-S consists of a synthase and a glutaminase subunit. The ImGP glutaminase HisH generates ammonia by hydrolyzing glutamine, which reacts at the active site of the synthase HisF with its substrate PrFAR. The two active sites within the ImGP-S from Thermotoga maritima lie 25 Å apart from each other and are connected by an ammonia channel. Moreover, the catalytic activity of HisH is dependent on complex formation and ligand binding to HisF (Beismann-Driemeyer & Sterner, 2001).
By mutating residues at the interface to alanine we found one ImGP-S variant with strongly decreased (D98A(F)) and two other variants (Y138A(H), K181A(H) with constitutive glutaminase activity. In contrast to the wild-type enzyme, these two variants allow for ammonia escape into the solvent, suggesting that glutaminase activity is dependent on ammonia consumption in ImGP-S. Moreover, we investigated the role of individual residues and of sequence stretches for the stability of complex formation.
The alanine exchanges Y138A(H) and K181A(H) at the interface result in a gain-of-function version of ImGP-S, showing constitutive glutaminase activity. The replacement of the large side chains by the small aliphatic one probably creates a hole in the protein structure, which facilitates NH3 efflux and the access of water to the active site and thus stimulates glutamine hydrolysis.
Complex formation with HisF is unaltered by these exchanges, since fluorescence titration showed no differences in the Kd value compared to the wild-type complex.
The alanine exchange of the interface residue D98(F) in the synthase subunit results in a reduction-of-function version of ImGP-S. Since D98(F) lies in the vicinity of the glutaminase active site it may contribute directly to glutamine hydrolysis in a yet unidentified way. Since residual activity can be detected in the physiological reaction, D98(F) is important but not essential for catalysis.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 15:11
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