Zusammenfassung (Englisch)
Chromatin is distributed non-randomly within the cell nucleus. Its spatial organization has been demonstrated to be important for nuclear metabolism such as, DNA replication, reparation or transcription. However, little is known about the functional implications resulting from its organization or the molecular driving forces responsible for chromatin organization.
In the course of this thesis, I ...
Zusammenfassung (Englisch)
Chromatin is distributed non-randomly within the cell nucleus. Its spatial organization has been demonstrated to be important for nuclear metabolism such as, DNA replication, reparation or transcription. However, little is known about the functional implications resulting from its organization or the molecular driving forces responsible for chromatin organization.
In the course of this thesis, I studied the budding yeast HMG-box protein Hmo1. An initial screen demonstrated that this chromatin-associated protein is genetically linked to the RNA polymerase (Pol) I, to genes coding for ribosomal proteins (RPGs) as well as to genes implicated in stress response. I could show that Hmo1 physically interacts with the rRNA coding gene transcribed by Pol I and with a subset of RPG promoters. Global expression analyses showed a clear dependence on Hmo1 for the expression of a sub-set of RPGs. An hmo1 deletion strain is also largely alleviated in repressing RPG transcription after TOR complex 1 inhibition. These results suggested that Hmo1 is implicated in Pol I transcription as well as RPG regulation. Preliminary in vitro transcription assays suggest a role of Hmo1 in Pol I initiation and elongation events.
Since Hmo1 is a bona fide nucleolar factor, I wanted to test the hypothesis if Pol II transcribed RPGs associated with Hmo1 are localized in the proximity of the nucleolus, as previously reported for Pol III encoded tRNA genes. Due to the small size of the yeast nucleus and the stochastic, sub-diffusive movement of DNA, we first needed to develop a new method allowing determination of gene localization probabilities with very high accuracy and with respect to the nucleolus. As a result of this collaborative approach, we could demonstrate by analyzing thousands of cells, that genes are confined into sub-nuclear volumes. These �gene territories� show a locus specific size and can be remodeled upon transcriptional activation. Applying this new method to Pol II transcribed genes required for ribosome biogenesis, such as the RPGs, indicates that the localization of the gene on the chromatin fiber has important implications for its three dimensional positioning. Genes in proximity to the centromere localize in front of the spindle pole body while RPGs further away from the extremities of the chromosome arm can also occupy a nucleolar-close territory. Furthermore, it also seems that neighboring genes are important positioning determinants.
All together, these results show that Hmo1 participates in mediating Pol I and RPG transcription regulation in response to growth conditions and that this important cross-talk between different RNA polymerases could be mediated by spatial co-positioning of the genes. Further analyses will be required to reveal the potential function of Hmo1 in this interplay.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Im Zellkern liegt die in Chromatin verpackte DNA nicht zufällig verteilt vor. Es wurde gezeigt, dass die räumliche Lokalisation von Chromatin einen wichtigen Einfluß auf nukleäre Prozesse wie DNA Replikation, Reparatur oder Transkription hat. Bisher gibt es jedoch nur wenige Hinweise auf die funktionellen Auswirkungen dieser Organisation sowie auf die molekularen Kräfte, die für die ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Im Zellkern liegt die in Chromatin verpackte DNA nicht zufällig verteilt vor. Es wurde gezeigt, dass die räumliche Lokalisation von Chromatin einen wichtigen Einfluß auf nukleäre Prozesse wie DNA Replikation, Reparatur oder Transkription hat. Bisher gibt es jedoch nur wenige Hinweise auf die funktionellen Auswirkungen dieser Organisation sowie auf die molekularen Kräfte, die für die Chromatinorganisation verantwortlich sind.
In der vorliegenden Arbeit wurde das HMG-box Protein Hmo1 aus der Bäckerhefe untersucht. Ein anfänglicher �Screen� zeigte, dass dieses Chromatin-assoziierte Protein mit Genen für RNA Polymerase (Pol) I, mit Genen, die für ribosomale Proteine (RPGs) kodieren, als auch mit Genen, die in der Stressantwort eine Rolle spielen genetisch in Verbindung steht. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass Hmo1 physisch mit dem durch Pol I transkribierten rRNA-kodierenden Gen, sowie mit einer Untergruppe von RPG Promotoren interagiert. Mittels globaler Expressionsanalysen konnte die Abhängigkeit der Expression von RPG-Untergruppen von Hmo1 bestätigt werden. Ein hmo1 Deletionsstamm kann die RPG Transkription nur noch stark vermindert reprimieren wenn der TOR Komplex 1 inhibiert wird. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Hmo1 sowohl in die Pol I Transkription, als auch in die RPG Regulation involviert ist. Erste in vitro Transkriptionassays deuten tatsächlich auf eine Funktion von Hmo1 bei der Pol I-Initiation und -Elongation.
Da Hmo1 primär im Nukleolus akkumuliert, wollte ich im Folgenden die Hypothese testen, ob Pol II transkribierte RPGs, die mit Hmo1 assoziieren, in der Umgebung des Nukleolus lokalisieren, so, wie es bereits für Pol III transkribierte tRNA Gene beschrieben wurde. Aufgrund der geringen Größe des Hefe-Zellkerns einerseits und der stochastisch, sub-diffusiven Bewegung der DNA andererseits, entwickelten wir zunächst eine Methode, die es ermöglicht höchst präzise die Aufenthalts-wahrscheinlichkeit eines Locus im Zellkern unter Berücksichtigung des Nukleolus zu bestimmen. Ein Ergebnis dieser kollaborativen Arbeit ist die Erkenntnis, dass Gene in definierten, sub-nukleären Volumina lokalisieren. Diese �Genterritorien� weisen eine Locus-spezifische Größe auf und können durch transkriptionelle Aktivierung umorganisiert werden. Bei der Anwendung dieser Methode auf Pol II transkribierte Gene, die für die Ribosomenbiogenese benötigt werden, wie RPGs, wurden Hinweise dafür gefunden, dass die Lokalisation der Gene auf der Chromatinfaser, Auswirkungen auf deren dreidimensionale Positionierung hat. Gene in der Nähe des Centromers finden sich bevorzugt vor dem Spindelpolkörperchen, während RPGs, die weiter entfernt von den Enden des Chromosomenarmes liegen, ein �Territorium� in der Nähe des Nukleolus einnehmen können. Zusätzlich scheinen benachbarte Gene eine wichtige Determinante dieser Positionierung zu sein.
Zusammenfassend zeigen diese Resultate, dass Hmo1 bei der Regulation der Pol I- und der RPG Transkription als Reaktion auf wechselnden Wachstumsbedingungen mitwirkt. Weiterhin weisen die Daten darauf hin, dass der essentielle �crosstalk� zwischen unterschiedlichen RNA Polymerasen durch die hier beschriebene räumlichen Co-Lokalisation von Genen vermittelt werden könnte. Weitere Analysen sind nötig, um die potentielle Aufgabe von Hmo1 in diesem Zusammenspiel aufzudecken.
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