Monoinfektionen treten in der freien Natur so gut wie nie auf, daher liefert die Verwendung von planktonisch kultivierten Bakterien zur Testung antimikrobieller Substanzen zwar zufriedenstellende Ergebnisse, diese können jedoch nicht mit klinischen Ergebnissen korrelieren [168,236]. Mikroorganismen haben verglichen zu planktonisch lebenden Bakterien eine gesteigerte Resistenz gegen äußere ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Monoinfektionen treten in der freien Natur so gut wie nie auf, daher liefert die Verwendung von planktonisch kultivierten Bakterien zur Testung antimikrobieller Substanzen zwar zufriedenstellende Ergebnisse, diese können jedoch nicht mit klinischen Ergebnissen korrelieren [168,236]. Mikroorganismen haben verglichen zu planktonisch lebenden Bakterien eine gesteigerte Resistenz gegen äußere Einflüsse, wie Austrocknung, Scherkräfte, antibakterielle Substanzen und Phagozytose [53,71,83]. Um einen therapeutischen Erfolg bei der Eliminierung der dreidimensionalen Biofilmstruktur in-vivo zu erreichen, muss die Wirkung antiseptischer Agenzien auch auf Biofilme in-vitro untersucht werden. Hierfür ist die Etablierung eines in-vitro Biofilmmodelles die Voraussetzung, da antimikrobielle Substanzen auf planktonisch kultivierte Bakterien häufig effektiver wirken, als auf adhärent wachsende Bakterien [51].
Die Etablierung eines in-vitro Biofilmmodelles erfolte mit drei, in verschiedenen Phasen der Biofilmbildung vorkommenden Bakterienstämmen, Actinomyces naeslundi, Fusobacterium nucleatum und Enterococcus faecalis. Für die Herstellung einer adhärenten Bakterienkultur wurden 96 Well-Mikrotiterplatten (tissue culture treated) verwendet. Die Biofilmbildung wurde anhand zwei unterschiedlicher Medien untersucht, dem BHI-Medium und einem künstlichen Speichelmedium nach Pratten et.al. [180], dem 1g/l Saccharose zugefügt wurden und das mit Stichstoff desoxygeniert wurde. Nach einer 30minütigen Vorbehandlung der Mikrotiterplatten mit dem jeweiligen Kultivierungsmedium wurden jeweils 80µl der zuvor hergestellten Bakteriensuspensionen in die Wells der Mikrotiterplatten pipettiert. Die Biofilmbildung fand unter statischen, anaerobischen Bedingungen statt. Anaerobe Verhältnisse wurden mittels einer Genbox (Genbox Jar 7l) und einem Gasgenerator herrgestellt. Es wurde das Wachstumsverhalten zu den Inkubationszeiten 12, 24, 48 und 72 Stunden untersucht. Als Maß für das Wachstum im Biofilm wurde die Veränderung der DNA-Menge der jeweiligen Bakterienstämme über die 16s Gensequenz mit der quantitativen real-time PCR (Light Cycler, Roche) bestimmt (n=12). Mittels LIVE/DEAD-Färbung (Biofilm Viability Kit von Invitrogen) wurde der prozentuale Anteil lebender Bakterien im Biofilm ermittelt (n=10), wobei nicht spezifiziert wurde welche Arten dies waren. Ein essentieller Nachweis eines Biofilmes mit seiner dreidimensionalen Struktur ist die Entstehung einer extrazellulären polymeren Substanz (EPS). Die EPS wurde mit dem Fluoreszenzfarbstoff Concanavalin A (ConA) nachgewiesen. Sowohl die LIVE/DEAD-Färbungen, als auch die ConA-Färbungen wurden durch zusammengesetzten Schichtaufnahmen visualisiert.
Die in-vitro Biofilmbildung mit dem BHI-Medium zeigte, im Gegensatz zum künstlichen Speichelmedium, keinerlei Adhäsionsverhalten der Bakterien. Mit Anwendung des künstlichen Speichelmediums sind alle drei untersuchten Bakterienarten adhärent in einem Biofilm signifikant gewachsen und zeigten tendenziell ein, mit der Kulturdauer zunehmendes Wachstum, dargestellt als zunehmende DNA-Konzentration. Die Auswertung von 10 unabhängig gewachsenen Biofilmen ergab, dass nach einer 72-stündigen Kultivierungszeit im Median 49,5% (range: 46% – 53%) der Bakterien im Biofilm lebend waren. Die Fluoreszenzfärbung der extrazellulären polymeren Substanz mit ConA konnte die Matrix in dem in-vitro gewachsenen Biofilm nachweisen und beweist die komplexe dreidimensionale mikrobielle Gemeinschaft.
Die in-vitro Biofilmbildung aus drei verschiedenen Bakterienstämmen konnte mit künstlichem Speichel als Kultivierungsmedium erfolgreich nachgewiesen werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Objectives: Most in-vitro studies on the antibacterial effects of antiseptics are performed on planktonic bacteria in monocultures, so far. However, this does not reflect the situation in the oral cavity with different bacteria symbiotically living in biofilms. Therefore, the aim of this study was to establish an in-vitro polymicrobial biofilm model which better simulates the oral conditions but ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Objectives: Most in-vitro studies on the antibacterial effects of antiseptics are performed on planktonic bacteria in monocultures, so far. However, this does not reflect the situation in the oral cavity with different bacteria symbiotically living in biofilms. Therefore, the aim of this study was to establish an in-vitro polymicrobial biofilm model which better simulates the oral conditions but keeps the advantage of in-vitro testing, namely the well-controlled experimental conditions. Methods: three bacterial strains, which are involved in the different phases of oral biofim formation (Actinomyces naeslundi (An; T14V), Fusobactrium nucleatum (Fn; ATCC 10953) and Enteroccus faecalis (Ef; ATCC 29212),) have been selected. Biofilm formation was studied on a polystyrol substrate from 96-well tissue culture plates under static anaerobic conditions using two nutrient media (BHI medium (BD, USA) and artificial saliva (Pratten et al., 2000) with 1g/l sucrose. Growth was determined separately for each bacterial strain after incubation periods of up to 72 hours using quantitative real-time PCR (Light Cycler, Roche) in n=12 independent experiments. The amount of living bacteria was determined using a live/dead stain (Biofilm Viability Kit, Invitrogen). The extracellular polymeric matrix (EPS) was visualized by Concanavalin A in a confocal laser microscope. Results: No bacterial adhesion was observed with BHI medium. However, adhesion and propagation of the bacterial strains with increasing incubation time was observed with the artificial saliva formulation. An and Ef showed significantly higher growth rates than Fn. Live/dead stain revealed a median of 49,9% (range: 46%-53%) live bacteria after 72 hours incubation and confocal laser microscopy showed a three-dimensional EPS containing structure. Conclusions: Selecting three relevant bacteria for intraoral biofilm formation we could establish a three-dimensional in-vitro biofilm model with adhering bacteria and extracellular matrix formation. The suitability of this model must be further evaluated testing antimicrobials with known activities.
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