Das eukaryotische Protein Cdc123 wurde ursprünglich als Zellproliferationsfaktor identifiziert, welcher essentiell für den Übergang von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus ist. Weitere Untersuchungen in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae brachten Cdc123 mit der Initiation der Translation, insbesondere mit der γ-Untereinheit des heterotrimeren Initiationsfaktors eIF2, in Verbindung. Die ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Das eukaryotische Protein Cdc123 wurde ursprünglich als Zellproliferationsfaktor identifiziert, welcher essentiell für den Übergang von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus ist. Weitere Untersuchungen in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae brachten Cdc123 mit der Initiation der Translation, insbesondere mit der γ-Untereinheit des heterotrimeren Initiationsfaktors eIF2, in Verbindung. Die Rolle von eIF2 bei der Translationsinitiation besteht in der Rekrutierung der mit Methionin beladenen Initiator-tRNA. Darüber hinaus ist eIF2 ein wichtiger Ansatzpunkt für die Regulation der Translationsinitiation. In einer vorangegangenen Dissertation (Frank Richter, 2006) konnte gezeigt werden, dass Cdc123 wichtig für die Integrität des eIF2-Heterotrimers und somit für die Funktionalität von eIF2 ist. Nun wurde die Interaktion von Cdc123 mit Gcd11 (eIF2γ) genauer charakterisiert und gezeigt, dass Cdc123 bevorzugt mit monomerem Gcd11 (eIF2γ) und nicht mit dem heterotrimeren eIF2-Komplex interagiert. Durch heterologe Expression in E. coli konnte außerdem die direkte Wechselwirkung von Cdc123 und Gcd11 nachgewiesen werden. Die Untersuchung von verkürzten Varianten deutet darauf hin, dass der N-terminale Bereich von Cdc123 an der Interaktion mit Gcd11 beteiligt ist. Bei Gcd11 ist die C-terminale Domäne (Domäne III) hinreichend und notwendig für die Interaktion mit Cdc123. Sowohl die Verringerung der Cdc123-Menge (durch Repression des GALL-Promotors), als auch die Verringerung der Cdc123-Gcd11-Interaktion (durch eine C-terminale Verkürzung von Gcd11) führen zu einer verringerten Assoziation der drei eIF2-Untereinheiten, was die Bedeutung von Cdc123 für die eIF2-Integrität unterstreicht. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Analyse der Phosphorylierung von Cdc123: In der Tat liegt Cdc123 unter Standard-Wachstumsbedingungen in phosphorylierter Form vor, wofür der C-terminale Bereich (AS 341-360) entscheidend ist. Außerdem führt die Überexpression bestimmter Kinasen (Cdc15, Mps1, Yck1 und Yck2) zu einer Hyperphosphorylierung von Cdc123, ebenso die Behandlung der Zellen mit dem mutagenen Agens MMS. Die Relevanz der Cdc123-Hyperphosphorylierung ist jedoch unklar, da keine Auswirkungen auf Integrität oder Funktionalität des eIF2-Komplexes eintraten. Des Weiteren ergaben sich in dieser Arbeit Hinweise, dass die Integrität von eIF2, und somit Cdc123, eine Rolle für die Adaptation an das Nährstoffangebot spielen könnte. So ist die Lokalisation von eIF2 in cytoplasmatischen Foci, welche durch Aminosäuremangel induziert wird, bei cdc123-Mutanten beeinträchtigt, vermutlich auf Grund der verringerten Assoziation der eIF2-Untereinheiten. Andererseits scheint eine zu hohe Menge an eIF2-Komplexen schädlich zu sein, wenn die bevorzugte Kohlenstoffquelle Glukose nicht zur Verfügung steht: In Raffinose/Galaktosemedium wirkt sich die Überexpression der drei eIF2-Untereinheiten negativ aus – allerdings nur, wenn Cdc123 zur Assemblierung der eIF2-Untereinheiten vorhanden ist.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The conserved eukaryotic protein Cdc123 was first identified as a cell proliferation factor involved in the G1/S transition of the cell cycle. Studies in Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) then linked Cdc123 to translation initiation, particularly to the γ-subunit of the heterotrimeric translation initiation factor eIF2. eIF2 recruits the initiator-tRNA for translation initiation and is a ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The conserved eukaryotic protein Cdc123 was first identified as a cell proliferation factor involved in the G1/S transition of the cell cycle. Studies in Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) then linked Cdc123 to translation initiation, particularly to the γ-subunit of the heterotrimeric translation initiation factor eIF2. eIF2 recruits the initiator-tRNA for translation initiation and is a key target for translation regulation. In a previous study (Frank Richter, 2006) Cdc123 was shown to be important for the integrity of the eIF2 heterotrimer and thus for eIF2 function. This thesis provides a more detailed characterization of the interaction of Cdc123 and Gcd11 (eIF2γ): Cdc123 preferentially binds to monomeric Gcd11 (eIF2γ), not to the heterotrimeric eIF2 complex. Direct interaction of Cdc123 and Gcd11 was confirmed by heterologous expression in E. coli. The analysis of truncated versions indicates that the N-terminal region of Cdc123 might be involved in the interaction with Gcd11. On the other hand, the C-terminal domain (domain III) of Gcd11 is necessary and sufficient for the interaction with Cdc123. Reduced amounts of Cdc123 (by repression of the GALL promoter) as well as reduced interaction of Cdc123 and Gcd11 (by C-terminal truncation of Gcd11) resulted in reduced association of the three eIF2 subunits, confirming the importance of Cdc123 for eIF2 integrity. Another topic addressed in this work is phosphorylation of Cdc123. Indeed, Cdc123 was phosphorylated under standard growth conditions and phosphorylation sites were found in its C-terminal region (amino acids 341-360). In addition, the overexpression of certain kinases (Cdc15, Mps1, Yck1 and Yck2) or exposure of cells to the mutagenic substance MMS caused hyperphosphorylation of Cdc123. However, the relevance of the Cdc123 hyperphosphorylation remains obscure, since no effects on integrity or functionality of the eIF2 complex were observed. Moreover, this study provides evidence that eIF2 integrity - and thus Cdc123 - might play a role in the adaptation to nutrient availability. The localization of eIF2 in cytoplasmic foci upon amino acid deprivation was compromised in cdc123 mutants, probably due to the reduced association of eIF2 subunits. On the other hand, excessive amounts of eIF2 complex seem to be unfavourable in the absence of glucose, the preferred carbon source of budding yeast: In raffinose/galactose medium the combined overexpression of eIF2 subunits had negative effects – but only, if Cdc123 was present to assemble the eIF2 complex.
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