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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-280409
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.28040
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
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Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 15 Januar 2013 |
Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Herbert Tschochner und Prof. Dr. Gunter Meister und Prof. Dr. Klaus Grasser |
Tag der Prüfung: | 1 März 2013 |
Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Herbert Tschochner |
Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
Stichwörter / Keywords: | ribosome synthesis, RNA polymerase I, ribonucleoprotein complex RNP, SSU processome, large ribosomal subunit, rDNA chromatin, co-transcriptional assembly |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 28040 |
Zusammenfassung (Englisch)
Eukaryotic ribosome biogenesis is a very complex process that includes synthesis of the structural components (ribosomal RNAs (rRNAs) and proteins (r-proteins)), processing and folding of rRNA precursors, as well as assembly of the r-proteins onto the rRNA. Ribosome biogenesis starts with the transcription of the genes encoding the rRNAs (rDNA) in the nucleolus by RNA polymerase I and III, and ...
Zusammenfassung (Englisch)
Eukaryotic ribosome biogenesis is a very complex process that includes synthesis of the structural components (ribosomal RNAs (rRNAs) and proteins (r-proteins)), processing and folding of rRNA precursors, as well as assembly of the r-proteins onto the rRNA. Ribosome biogenesis starts with the transcription of the genes encoding the rRNAs (rDNA) in the nucleolus by RNA polymerase I and III, and includes transport of pre-ribosomal particles (pre-ribosomes) through the nucleus and export into the cytoplasm, where the final maturation steps occur. In addition to the structural components, these processes require the function of ~75 small nucleolar RNAs and of more than 150 non-ribosomal proteins termed biogenesis factors, which transiently interact with different pre-ribosomes. It could be shown that several subsets of biogenesis factors form protein modules, which are supposed to constitute building blocks of pre-ribosomes and/or to function together in ribosome biogenesis.
In this work, a protein complex consisting of the proteins Rrp5p, Noc1p and Noc2p from Saccharomyces cerevisiae could be reconstituted from heterologously expressed proteins. Noc1p and Noc2p are biogenesis factors of the large ribosomal subunit (LSU), whereas Rrp5p is required for maturation of both the large and the small ribosomal subunit (SSU). Analyses of pairwise interactions between the proteins, as well as negative stain electron microscopy of the purified complex provided further insights into architectural and structural features of the Rrp5p/Noc1p/Noc2p biogenesis factor module.
Ex vivo purifications of the module components and analyses of co-purified RNAs and proteins indicated that the Rrp5p/Noc1p/Noc2p module is predominantly associated with the first specific pre-LSU particles. In addition, Rrp5p, Noc1p and Noc2p showed association with early, common ribosomal precursor particles, which are formed before the pathways leading to the small and the large ribosomal subunit are separated. Furthermore, the module components co-purified specific regions of rDNA chromatin from cells treated with crosslinking reagents, and Rrp5p and Noc1p were identified as components of chromatin transcribed by RNA polymerase I. Accordingly, the Rrp5p/Noc1p/Noc2p module appeared to be associated with nascent rRNA precursor transcripts, providing further evidence that the module is recruited very early in ribosome biogenesis.
Individual inactivation or depletion of Rrp5p, Noc1p or Noc2p in vivo resulted in severely decreased levels of LSU specific pre-rRNA species and the appearance of aberrant pre-rRNA fragments. In addition, analyses of truncated noc1 alleles indicated that impaired interactions of Noc1p with Noc2p, Rrp5p or pre-rRNA result in similar pre-rRNA processing phenotypes, suggesting that in absence of the Rrp5p/Noc1p/Noc2p module pre-ribosomes are destabilised and pre-rRNAs are prone to degradation. Furthermore, in vivo depletion of one module component and subsequent analyses of the association of the respective non-depleted proteins with pre-rRNA indicated a mutually independent binding of Rrp5p and Noc1p/Noc2p to pre-ribosomes. Accordingly, the module most probably has several binding sites on pre-ribosomal particles.
In summary, the results presented here suggest that formation of the Rrp5p/Noc1p/Noc2p module plays a role in the structural organisation of early LSU precursor particles and thereby contributes to their stability, possibly by preventing inappropriate access of endo- and exonucleases to pre-rRNA. Besides, potential mechanisms of the Noc1p/Noc2p independent function of Rrp5p in SSU biogenesis, and a model for the recruitment of the Rrp5p/Noc1p/Noc2p module to pre-ribosomes are discussed.
Future studies will be required to determine the structure and architecture of this biogenesis factor module in detail. Furthermore, analyses of the RNA binding and folding activities of the module components, and of the impact of the module on the recruitment of r-proteins and/or other biogenesis factors to early pre-ribosomes will help to understand the precise molecular function of the Rrp5p/Noc1p/Noc2p module in ribosome biogenesis. As all three proteins have homologues in higher eukaryotes, it will be interesting to investigate if formation and function of this module are conserved in evolution.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die eukaryotische Ribosomenbiogenese ist ein hochkomplexer Prozess, der die Synthese der strukturellen Komponenten (ribosomale RNAs (rRNAs) und Proteine (r-Proteine)), Prozessierung und Faltung der rRNA Vorläufer, sowie die Assemblierung der r-Proteine auf der rRNA beinhaltet. Die Ribosomenbiogenese beginnt in einem spezialisierten Teil des Zellkerns, dem Nukleolus, mit der von den RNA ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die eukaryotische Ribosomenbiogenese ist ein hochkomplexer Prozess, der die Synthese der strukturellen Komponenten (ribosomale RNAs (rRNAs) und Proteine (r-Proteine)), Prozessierung und Faltung der rRNA Vorläufer, sowie die Assemblierung der r-Proteine auf der rRNA beinhaltet. Die Ribosomenbiogenese beginnt in einem spezialisierten Teil des Zellkerns, dem Nukleolus, mit der von den RNA Polymerasen I und III katalysierten Transkription der Gene, die die rRNAs (rDNA) codieren. Außerdem umfasst sie den Transport prä-ribosomaler Partikel (Präribosomen) durch den Zellkern und deren Export ins Cytoplasma, wo die finalen Reifungsschritte stattfinden. Zusätzlich zu den strukturellen Komponenten erfordern diese Prozesse die Funktion von etwa 75 kleinen nukleolären RNAs und von mehr als 150 nicht-ribosomalen Proteinen, die als Biogenesefaktoren bezeichnet werden und vorübergehend mit verschiedenen Präribosomen interagieren. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene Gruppen dieser Biogenesefaktoren Proteinkomplexe oder „Module“ bilden, die vermutlich vorgeformte Bausteine von Präribosomen darstellen und/oder in der Ribosomenbiogenese zusammenwirken.
In dieser Arbeit konnte ein Proteinkomplex, der aus den Proteinen Rrp5p, Noc1p und Noc2p der Hefe Saccharomyces cerevisiae besteht, aus heterolog exprimierten Proteinen rekonstruiert werden. Noc1p und Noc2p sind Biogenesefaktoren der großen ribosomalen Untereinheit (large ribosomal subunit, LSU), wohingegen Rrp5p sowohl für die Reifung der großen, als auch der kleinen ribosomalen Untereinheit erforderlich ist. Die Untersuchung paarweiser Wechselwirkungen zwischen diesen Proteinen, sowie elektronenmikroskopische Analysen der gereinigten und mit Schwermetall kontrastierten Proteinkomplexe lieferten zusätzliche Erkenntnisse bezüglich architektureller und struktureller Eigenschaften des Rrp5p/Noc1p/Noc2p Biogenesefaktormoduls.
Ex vivo Reinigungen der Modulkomponenten und Analysen der co-gereinigten RNAs und Proteine deuteten darauf hin, dass das Rrp5p/Noc1p/Noc2p Modul vor allem mit den ersten spezifischen Vorläufern der großen ribosomalen Untereinheit assoziiert ist. Daneben zeigten Rrp5p, Noc1p und Noc2p Assoziation mit früheren, gemeinsamen Vorläuferpartikeln der großen und kleinen ribosomalen Untereinheiten. Außerdem konnten aus Extrakten chemisch quervernetzter Hefezellen spezifische Bereiche des rDNA Chromatins zusammen mit den Modulkomponenten aufgereinigt werden, und Rrp5p und Noc1p wurden als Bestandteile von RNA Polymerase I transkribiertem Chromatin identifiziert. Demzufolge scheint das Rrp5p/Noc1p/Noc2p Modul mit naszierenden rRNA Vorläufertranskripten assoziiert zu sein, was einen weiteren Hinweis dafür liefert, dass das Modul sehr früh in der Ribosomenbiogenese rekrutiert wird.
In vivo Inaktivierung oder Depletion einzelner Proteine führte zu stark verringerten Mengen LSU spezifischer prä-rRNA Spezies und zur Bildung aberranter prä-rRNA Fragmente. Desweiteren wiesen Untersuchungen verschiedener verkürzter noc1 Allele darauf hin, dass beeinträchtigte Interaktionen von Noc1p mit Noc2p, Rrp5p oder prä-rRNA zu einem ähnlichen prä-rRNA Prozessierungsphänotyp führen. Dies lässt vermuten, dass Präribosomen in Abwesenheit des Rrp5p/Noc1p/Noc2p Moduls destabilisiert sind und abgebaut werden. Außerdem lieferten Experimente, in denen eine Modulkomponente in vivo depletiert wurde und anschließend die Assoziation der nicht depletierten Proteine mit prä-rRNA untersucht wurde, Hinweise dafür, dass Rrp5p und Noc1p/Noc2p unabhängig voneinander an Präribosomen binden können. Demzufolge hat das Modul aller Wahrscheinlichkeit nach mehrere Bindestellen an Präribosomen.
Zusammenfassend führen die hier geschilderten Ergebnisse zu der Schlussfolgerung, dass die Ausbildung des Rrp5p/Noc1p/Noc2p Moduls zur strukturellen Organisation früher LSU Vorläuferpartikel und somit zu deren Stabilisierung beiträgt, möglicherweise indem unerwünschter Zugang von Endo- und Exonucleasen zu prä-rRNA verhindert wird. Außerdem werden mögliche Mechanismen für die Noc1p/Noc2p unabhängige Funktion von Rrp5p in der Biogenese der kleinen ribosomalen Untereinheit und ein Modell für die Rekrutierung des Rrp5p/Noc1p/Noc2p Moduls an Präribosomen diskutiert.
Zukünftige Studien sind erforderlich um die Struktur und Architektur dieses Biogenesefaktormoduls im Detail aufzuklären. Außerdem sollten Untersuchungen bezüglich der RNA Bindungs- und Faltungsaktivitäten der Modulkomponenten, sowie des Einflusses des Moduls auf die Rekrutierung von r-Proteinen und/oder anderer Biogenesefaktoren an frühe Präribosomen dazu beitragen, die detaillierte molekulare Funktion des Rrp5p/Noc1p/Noc2p Moduls in der Ribosomenbiogenese zu verstehen. Da alle drei Proteine Homologe in höheren Eukaryoten haben, könnte die Ausbildung und Funktion des Moduls in der Evolution konserviert sein.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 02:51