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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-289120
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.28912
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
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Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 2 Oktober 2014 |
Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Thomas Dresselhaus |
Tag der Prüfung: | 30 August 2013 |
Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Klaus Grasser) |
Stichwörter / Keywords: | auxin, cytokinin, PIN proteins, AGCVIII kinases, plant parasitic nematodes, phloem development |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 28912 |
Zusammenfassung (Englisch)
The phytohormone auxin is a major determinant of plant growth and development. Many aspects of its action depend on the formation of local maxima or gradients within tissues. PIN-FORMED (PIN) proteins facilitate auxin efflux from cells and, by their dynamic polar localization, provide a basis for its directional transport. PIN-dependent auxin transport is regulated by several members of the plant ...
Zusammenfassung (Englisch)
The phytohormone auxin is a major determinant of plant growth and development. Many aspects of its action depend on the formation of local maxima or gradients within tissues. PIN-FORMED (PIN) proteins facilitate auxin efflux from cells and, by their dynamic polar localization, provide a basis for its directional transport. PIN-dependent auxin transport is regulated by several members of the plant specific AGCVIII kinase family. Phosphorylation of the central serine residues in three conserved TPRXS(N/S) motifs by PIONOID (PID) is crucial for polar targeting of PINs. The D6 protein kinases (D6PKs) were also shown to be involved in the control of polar auxin transport and are functionally linked to PIN1 and PIN3, however they do not interfere with PIN subcellular localization.
In this work, the X. laevis oocyte expression system was used to study the impact of D6PK and other representative members of the AGCVIII kinase family on transport activity of PIN1 and PIN3. An assay was established that allowed monitoring auxin efflux after direct injection of oocytes with radiolabeled substrate. It could be shown that co-expression of PIN1 and PIN3 proteins with D6PK or PID results in phosphorylation of PINs and in enhanced auxin efflux. Contrarily, expression of PIN proteins alone did not cause measurable auxin efflux when compared to water-injected control oocytes. Based on the observation that a kinase-inactive version of D6PK could no longer stimulate PIN-mediated auxin efflux, it was concluded that phosphorylation is essential for PIN function. Activation of PIN1 and PIN3 could be achieved by co-expression of D6PK and PID, but not two other members of the AGCVIII kinase family, PHOT1 and UNC, demonstrating the specificity of the interaction between PINs and D6PK / PID.
Analyses of different mutants lead to the identification of phosphorylation target sites that are essential for D6PK / PID – mediated PIN1 transport activity. A serine to alanine substitution at position 271 caused decreased auxin efflux from PIN1S271A / D6PK co-expressing oocytes, but had no effect on PID mediated activation, indicating that S271 is important for D6PK function, while PID acts independently of S271, i.e. vy phosphorylation of different residues. Consistently, an opposite effect was observed in a PIN1 S231A/S252A/S290A triple mutant with alanines replacing the central serines in the TPRXS(N/S) motifs. The different impacts of the S271A and the S231A/S252A/S290A mutations on D6PK and PID function suggested that activation of PIN1 by D6PK is mediated preferentially via phosphorylation of S271A whereas PID favors the central serines in the TPRXS(N/S) motifs, thereby regulating polarity as well as activity. While both PIN1S271A as well as the triple mutant PIN1 S231A/S252A/S290A could still mediate enhanced auxin efflux from oocytes when co-expressed with D6PK or PID, although to a varying extent, transport activity was almost completely lost in a combined quadruple mutant PIN1 S231A/S252A/S271A/S290A. The results obtained from the analysis of PIN1 mutants suggest that the main phosphorylation sites that contribute to PIN1 activatability by D6PK and PID have been identified and include S271 as well as S231/S252/S290. However, it was clearly demonstrated that not all of the sites have to be phosphorylated at the same time to confer transport activity to PIN1. In fact, phosphorylation of either S271 or one or more of the S231/S252/S290 sites is sufficient for transport activity under the given experimental conditions.
PIN3 generally exhibited higher transport rates than PIN1 when co-expressed with an activating kinase, probably reflecting its function in processes that involve rapid polar redistribution of auxin. A serine to alanine exchange at position 262 of PIN3 which corresponds to S271 in PIN1 had no effect on the activation by either D6PK or PID when compare to wild type PIN3 indicating that different amino acid residues are important for PIN3 activity.
In summary, the results obtained in the first part of this work provide evidence that the transport activity of the auxin efflux carriers PIN1 and PIN3 is controlled by the AGCVIII kinases D6PK and PID and depends on phosphorylation of specific amino acid residues, thereby giving important insights into the biochemical mechanisms that control PIN protein function.
In the second part of the thesis, the role of phytohormone responses in plant-nematode interactions was studied. Plant parasitic nematodes are destructive pathogens with a broad host range and cause enormous yield losses each year. The sedentary endoparasitic nematodes are divided into two groups, the root knot nematodes (RKN) and the cyst nematodes (CN). The free living juveniles of RKN and CN enter their host plant’s roots and induce the formation of highly specialized feeding sites termed giant cells or syncytia, respectively, in the vascular cylinder. From these feeding sites, all the nutrients required for growth and development of the nematodes are withdrawn. Giant cells and syncytia are functionally equivalent and represent strong terminal sink tissues. However they differ in their genesis and in the way how they are loaded with nutrients. While syncytia are connected to the surrounding vasculature by plasmodesmata, giant cells are symplastically isolated and nutrient uptake occurs via membrane dependent processes. Both syncytia and giant cells are enclosed in vascular tissue which is formed de novo and is required for the transport of nutrients towards the feeding sites. The unloading phloem that is induced around syncytia consists of sieve elements and companion cells with the ratio shifted towards an excess of sieve elements. Giant cells on the other hand are surrounded by a unique phloem tissue that is built up of nucleate sieve elements whereas companion cells are absent.
It was shown before that both CN and RKN secrete auxin- and cytokinin-like compounds and that auxin plays an important role in the establishment of the feeding sites. However, nothing was known about how the vascularization of syncytia and giant cells is controlled and whether phytohormones play a role in this process. Therefore auxin and cytokinin responses were monitored in nematode infected Arabidopsis roots using the synthetic hormone responsive promoters DR5 and TCS, respectively, fused to the coding sequence for ER-localized green fluorescent protein (GFP). GFP fluorescence was recorded and immunohistochemical experiments were performed in order to identify the cell types within the nematode induced tissues that responded to the phytohormones. This provided insights into a possible function of phytohormone dependent processes in feeding site vascularization. In uninfected differentiated parts of control roots a constitutive auxin response was found in companion cells, but no response to cytokinin mediated by B-type response regulators was observed. Neither giant cells nor syncytia themselves responded to auxin or cytokinin at the timepoints of the infection cycle that were analyzed in this work but the response was limited to cells that surrounded the feeding sites. The observed hormone responses differed between RKN and CN-induced tissues.
In developing root knots, an auxin response in cells around the giant cells preceded their subsequent differentiation into sieve elements, which were identified using a well established sieve element marker. Possibly, the auxin response primes these cells for the differentiation process. GFP signal was retained even after the responding cells had assumed sieve element identity while cells that tested positive only for GFP but not for the sieve element marker were an exception in the mature root knot. The latter observation adds further evidence to the previously described finding that companion cells are absent from fully developed root knots. Cytokinin signaling could not be observed in root knots of PTCS:ER-GFP plants which means that either cytokinin levels are low or cells are not susceptible to the signal.
In contrast to the situation in root knots, the phloem around syncytia responded to both hormones. Auxin response was detected in companion cells and sieve elements while cytokinin response was limited to the sieve elements. Taking into account the distinct characteristics of the phloem tissues around syncytia and giant cells and the differential hormone responses, the ratio of cytokinin and auxin response might contribute to the identity of the de novo formed phloem, i.e. metaphloem in CN induced tissues and protophloem in RKN induced tissues.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Wachstum und Entwicklung von Pflanzen werden maßgeblich durch das Phytohormon Auxin beeinflusst. Sehr häufig spielt dabei die Ausbildung von Konzentrationsgradienten oder lokalen Maxima eine wichtige Rolle. In diesen Prozessen nehmen die PIN-FORMED (PIN) Proteine eine zentrale Rolle ein, indem sie den Auxin Efflux aus den Zellen vermitteln und zusätzlich durch ihre polare subzelluläre ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Wachstum und Entwicklung von Pflanzen werden maßgeblich durch das Phytohormon Auxin beeinflusst. Sehr häufig spielt dabei die Ausbildung von Konzentrationsgradienten oder lokalen Maxima eine wichtige Rolle. In diesen Prozessen nehmen die PIN-FORMED (PIN) Proteine eine zentrale Rolle ein, indem sie den Auxin Efflux aus den Zellen vermitteln und zusätzlich durch ihre polare subzelluläre Lokalisierung die Richtung des Transportes innerhalb der Pflanze vorgeben. PIN-basierter Auxin Transport wird durch verschiedene Mitglieder der Pflanzen-spezifischen AGCVIII Kinase Familie reguliert. In Arabidopsis ist die Phosphorylierung der zentralen Serin-Reste in drei konservierten TPRXS/(N/S) durch PINOID (PID) von entscheidender Bedeutung für die korrekte polare Lokalisierung der Proteine innerhalb der Zelle. Auch für die vier Mitglieder der D6 Protein Kinasen (D6PKs) wurde eine funktionelle Verbindung zu PIN Proteinen, insbesondere PIN1 und PIN3, gezeigt. D6PKs nehmen eine wichtige Funktion in der Kontrolle von polarem Auxin Transport ein, ohne jedoch die Lokalisation von PIN Proteinen zu beeinflussen.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von D6PK und weiteren repräsentativen Vertretern der AGCVIII Kinase Familie auf die Transportaktivität von PIN1 und PIN3 im Expressionssystem der X. laevis Oocyten untersucht. Dazu wurde ein experimentelles Verfahren etabliert, das es erlaubt, Auxin Efflux nach direkter Injektion der Oocyten mit radioaktiv markiertem Substrate zu messen. Mit Hilfe dieser Methode konnte gezeigt werden, dass die Koexpression von PIN1 und PIN3 mit den Kinasen D6PK bzw. PID in einer Phosphorylierung der PIN Proteine sowie erhöhtem Auxin Efflux resultiert. Die Expression der PIN Proteine ohne zusätzliche Kinase führte dagegen zu keinem von Wasser-injizierten Kontroll-Oocyten unterscheidbaren Auxin Efflux. Ebenso konnte durch Koexpression einer inaktiven D6PK Variante keine erhöhte Transportaktivität hervorgerufen werden. Phosphorylierung der PIN Proteine ist demnach entscheidend für ihre Transportaktivität in X. laevis Oocyten. Die Spezifität der Interaktion zwischen PIN Proteinen und D6PK bzw. PID wurde durch Untersuchungen bestätigt, die zeigten, dass zwei weitere Vertreter der AGCVIII Familie, PHOTOTROPIN1 (PHOT1) und UNICORN (UNC), keine Transportaktivität vermitteln können.
Durch die Analyse verschiedener PIN1 Varianten mit Punktmutationen an potentiellen Phosphorylierungsstellen konnten Aminosäurereste, die für die D6PK bzw. PIN-induzierte Aktivierung von essentieller Bedeutung sind, identifiziert werden. Ein Austausch des konservierten Serins S271 gegen Alanin führte zu einer reduzierten Aktivierbarkeit dieser Mutante durch D6PK, wohingegen die Transportaktivität bei Koexpression von PID der von Wildtyp PIN1 entsprach. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass S271 wichtig für die D6PK-vermittelte Transportaktivität von PIN1 ist, während PID unabhängig von diesem Serinrest agiert. Der entgegengesetzte Effekt, d.h. eine effektivere Aktivierung durch D6PK im Vergleich zu PID, wurde bei der Untersuchung einer Dreifach-Mutante beobachtet, in der die zentralen Serine innerhalb der konservierten TPRXS(N/X) durch Alanine ersetzt waren. Die unterschiedlichen Auswirkungen der S271A und der S231A/S252A/S290A Mutationen auf die Funktion von D6PK und PID weisen darauf hin, dass D6PK präferentiell an der Stelle S271 phosphoryliert, während die Aktivierung durch PID bevorzugt durch Modifikation der Serine in den TPRXS(N/X) Motiven, welche zusätzlich eine Rolle bei der polare Lokalisierung von PIN1 in pflanzlichen Zellen spielen, erreicht wird. Die Kombination der S271A und S231A/S252A/S290A Mutationen führte zum nahezu vollständigen Verlust der Aktivierbarkeit der Vierfach-Mutante. Es kann daher angenommen werden, dass die für die D6PK- bzw. PID-induzierte Transportfunktion essentiellen Aminosäurereste identifiziert wurden, wobei eine gleichzeitige Phosphorylierung aller vier Stellen nicht erforderlich für die Aktivität des Proteins ist. Vielmehr kann diese entweder durch S271-Phosphorylierung oder durch Phosphorylierung der Serine in den TPRXS(N/X) Motiven vermittelt werden.
Ein Vergleich der Transportraten, die durch Expression von PIN1 und PIN3 in Gegenwart von D6PK oder PID erzielt werden konnten, zeigte, dass PIN3 allgemein höheren Auxin Efflux verursacht als PIN1. Das beobachtete Ergebnis ist sehr gut mit der Funktion des Proteins in Tropismus-Prozessen, welche eine schnelle Umverteilung von Auxin erfordern, vereinbar. Ein Serin/Alanin-Austausch an Position 262 von PIN3, welche S271 in PIN1 entspricht, wirkte sich unter den gegebenen experimentellen Bedingungen nicht auf die Transportaktivität des Proteins bei Koexpression mit D6PK oder PID aus. Dieser Aminosäurerest spielt daher in PIN3 möglicherweise keine entscheidende Rolle für die Transportaktivität.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass D6PK und PID die Transportaktivität von PIN Proteinen durch Phosphorylierung spezifischer Aminosäurereste regulieren. Durch Benutzung des heterologen X. laevis Expressionssystem konnten somit wichtige Einblicke in die biochemischen Mechanismen, die der Regulation des PIN-vermittelten Auxin Transportes zugrunde liegen, gewonnen werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle von Phytohormonantworten während der Interaktion zwischen pflanzenparasitischen Nematoden und ihrer Wirtspflanze untersucht. Pflanzenparasitische Nematoden, deren Wirtsspektrum eine Vielzahl von Nutzpflanzen umfasst, verursachen jährlich erhebliche Ernteausfälle. Die sedentären endoparasitischen Nematoden werden in zwei Gruppen unterteilt, die Wurzelgallennematoden (WGN) und die Zystennematoden (ZN). Die frei lebenden Larven dieser Nematoden dringen in die Wurzeln ihrer Wirtspflanze ein und induzieren in der Stele die Ausbildung spezialisierter Fütterungsstrukturen, sogenannter Riesenzellen bzw. Synzytien, durch die sie der Pflanze Nährstoffe entziehen. Sowohl Riesenzellen als auch Synzytien stellen starke terminale Sinkgewebe dar und sind somit funktionell äquivalent. Sie unterscheiden sich jedoch in ihrer Entstehung und in der Art der Nährstoffbeladung. Diese erfolgt symplastisch bei Synzytien und apoplastisch im Fall der Riesenzellen. Beide Arten von Fütterungsstrukturen sind in Leitgewebe eingebettet, welches im Verlauf der Infektion de novo gebildet wird. In der Umgebung der Syncytien findet man die Induktion von Phloem, das aus Siebelementen und Geleitzellen besteht, wobei das Verhältnis zu Gunsten der Siebelemente verschoben ist. Riesenzellen hingegen sind von einem einzigartigen Phloemgewebe umgeben, das ausschließlich aus Siebelementen, welche Kerne enthalten, aufgebaut ist, während Geleitzellen vollständig fehlen.
Es ist bekannt, dass ZN und WGN Auxin- und Cytokinin-ähnliche Substanzen sekretieren und dass Auxin eine wichtige Funktion bei der Etablierung der Fütterungsstrukturen in der Wirtspflanze einnimmt. Jedoch sind die Mechanismen, die der Vaskularisierung der Fütterungsstrukturen zu Grunde liegen sowie die Rolle, die Phytohormone in diesem Prozess einnehmen, weitgehend unverstanden. In der vorliegenden Arbeit sollten daher die Auxin- und Cytokinin-Antworten in infizierten Wurzeln von Arabidopsis mit Hilfe der synthetischen Hormon-induzierbaren Promotoren DR5 und TCS, welche jeweils mit der kodierenden Sequenz für ER-lokalisiertes Grün fluoreszierendes Protein (GFP) fusioniert waren, untersucht werden. Mit Hilfe immunohistochemischer Experimente und Fluoreszenz-mikroskopie wurden Zellen innerhalb der Nematoden-induzierten Gewebe, die eine Hormonantwort aufweisen, identifiziert. Dadurch konnten erste Einblicke in eine mögliche Funktion von Auxin- und Cytokinin-abhängigen Prozessen bei der Vaskularisierung Nematoden-induzierter Fütterungsstrukturen gewonnen werden. Zunächst konnte gezeigt werden, dass in nicht infizierten, differenzierten Bereichen von Kontrollwurzeln eine konstitutive Auxin-Antwort in Geleitzellen stattfindet, es jedoch nicht zu einer Cytokinin-Antwort in vergleichbaren Bereichen von Kontrollwurzeln kommt. Weder in Riesenzellen noch in Synzytien konnte zu den in dieser Arbeit analysierten Zeitpunkten des Infektionszyklus eine Hormonantwort beobachtet werden. In den die Fütterungsstrukturen umgebenden Geweben, welche die Vaskulatur ausbilden, fand hingegen eine hormon-abhängige Expression von GFP statt. Dabei unterschieden sich die Hormonantworten in den durch ZN und WGN induzierten Geweben.
Im Fall der sich entwickelnden Wurzelgallen konnte gezeigt werde, dass eine Auxin-Antwort in den an die Riesenzellen angrenzenden proliferierenden Zellen stattfindet, bevor sich diese zu Siebelementen differenzieren. Möglicherweise fungiert der Auxin-Stimulus in diesen Zellen als Auslöser für den Differenzierungsprozess. Das GFP-Signal blieb auch in bereits differenzierten Siebelementen in vollständig entwickelten Wurzelgallen erhalten, jedoch wurden in diesen späten Stadien nur in Ausnahmefällen Zellen gefunden, die ausschließlich durch das GFP-Antiserum erkannt wurden, ohne gleichzeitig auch positiv für den Siebelement-Marker RS6 zu testen. Diese Beobachtung bestätigt, dass in vollständig vaskularisierten Wurzelgallen keine Geleitzellen vorhanden sind. In infizierten PTCS:ER-GFP Pflanzen konnte kein GFP-Signal in Wurzelgallen und somit keine Cytokinin-Antwort nachgewiesen werden, was einerseits auf niedrige Cytokinin-Konzentrationen unterhalb des Schwellenwertes für eine Aktivierung des synthetischen Promoters oder auf eine reduzierte Sensitivität der Zellen innerhalb der Wurzelgallen gegenüber Cytokinin zurückzuführen ist.
Im Gegensatz zu der in Wurzelgallen auftretenden Situation konnte in der Vaskulatur in der Umgebung der Zystennematoden-induzierten Synzytien sowohl eine Auxin- als auch eine Cytokinin-Atwort nachgewiesen werden. Die Auxin Antwort trat dabei sowohl in Geleitzellen als auch in Siebelementen auf, wohingegen die Cytokinin-Antwort auf die Siebelemente beschränkt war. Da die Induktion der verschiedenen Phloem-Typen in WGN- und ZN-induzierten Geweben mit einer differentiellen Hormonantwort einhergeht, ist es denkbar, dass das Verhältnis von Auxin zu Cytokinin bzw. die Stärke der einzelnen Antworten zur Identität des jeweiligen Phloems, also Protophloem in Wurzelgallen und Metaphloem in der Umgebung der Synzytien, beiträgt.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 01:45