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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-291180
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.29118
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 5 Februar 2014 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Michael Thomm und Prof. Dr. Herbert Tschochner und Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Tag der Prüfung: | 15 November 2013 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) > Prof. Dr. Michael Thomm |
| Stichwörter / Keywords: | Trigger loop, RNA Polymerase, Pyrococcus furiosus |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 29118 |
Zusammenfassung (Englisch)
RNA polymerases (RNAPs) carry out transcription in all living organisms. Whereas only one RNAP is present in bacteria and archaea, eukaryotes possess three to five specialized nuclear RNA polymerases (RNAP I, II, III, IV and V). To date, various RNAP structures have elucidated functional mechanisms of transcription, but biochemical analysis on eukaryotic RNAP II mutants are generally restricted ...
Zusammenfassung (Englisch)
RNA polymerases (RNAPs) carry out transcription in all living organisms. Whereas only one RNAP is present in bacteria and archaea, eukaryotes possess three to five specialized nuclear RNA polymerases (RNAP I, II, III, IV and V). To date, various RNAP structures have elucidated functional mechanisms of transcription, but biochemical analysis on eukaryotic RNAP II mutants are generally restricted to viable yeast strains. The active site of the RNAP catalyzes RNA chain growth by phosphodiester bond formation. The active site of all RNAPs contains two Mg2+ ions and an evolutionarily conserved mobile element, the trigger loop (TL) that functions in the elongation phase of transcription. Employing the reconstituted archaeal in vitro transcription system of Pyrococcus furiosus, we analyzed deletion mutants of the trigger loop and introduced alanine substitutions at key residues A'' Q80, A'' L83 and A'' H87. Furthermore, four supplementary mutants were analyzed in order to clarify their participation in NTP/2'dNTP discrimination.
The work of this thesis reveals that the archaeal TL is absolutely essential for transcription initiation, specially for capturing the incoming NTPs before a stable DNA–RNA hybrid is present in the active centre. Moreover, catalysis in initially transcribing complexes, active site closure and synthesis stimulation by the TL were crucial, as A'' H87 and the TLtip region were essential for initiation.
In vitro elongation assays also provided insights into TL function during the discrimination of correct NTPs from wrong dNTPs. Although A'' L83 and A'' H87 contribute to the recognition of the correct NTP and to the catalysis, A'' Q80 contributes to the recognition of the 2′OH-group of the NTP, indicating the critical role of the interaction between the TL and the NTP for the nucleotide incorporation fidelity.
Transcription fidelity also relies on proofreading, a post-incorporation mechanism that involves cleavage of a dinucleotide from the RNA 3′-end containing the misincorporated nucleotide. The TL is not required for the intrinsic cleavage activity of the enzyme but influences the translocation by being part of the Brownian ratchet that underlies translocation. The data shown here also suggests the critical role of the residue A'' L83 in backtracked complex stability. Proofreading is stimulated by extrinsic RNA cleavage factors such as TFS, and we found that the TL is also dispensable for TFS-stimulated cleavage, consistent with structures illustrating that the TL is in the locked conformation in the presence of the eukaryotic TFS counterpart, TFIIS.
Finally, our results revealed a function of the TL in transcription termination. We show that the sensitivity of the archaeal RNAP to poly-T sequences is increased on TL truncation, showing that the TL prevents aberrant termination at non-terminator sites, to ensure processive RNA synthesis.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
RNA Polymerasen (RNAPs) sind verantwortlich für die Transkription in allen Lebensformen. Während Bakterien und Archaeen nur eine RNAP besitzen, haben Eukaryonten drei bis fünf spezialisierte nukleare RNAPs (RNAP I, II, III, IV und V). In der Zwischenzeit haben verschiedene RNAP Strukturanalysen zum Verständnis des funktionellen Mechanismus der Transkription beigetragen, biochemische Studien von ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
RNA Polymerasen (RNAPs) sind verantwortlich für die Transkription in allen Lebensformen. Während Bakterien und Archaeen nur eine RNAP besitzen, haben Eukaryonten drei bis fünf spezialisierte nukleare RNAPs (RNAP I, II, III, IV und V). In der Zwischenzeit haben verschiedene RNAP Strukturanalysen zum Verständnis des funktionellen Mechanismus der Transkription beigetragen, biochemische Studien von Mutanten der eukaryontischen RNAP II hingegen sind im Allgemeinen auf lebensfähige Hefestämme beschränkt. Das aktive Zentrum der RNAP katalysiert die Elongation der RNA-Kette durch die Bildung von Phosphodiesterbindungen. Das active Zentrum aller RNAPs besitzt zwei Mg2+ Ionen sowie ein evolutionär konserviertes Element, Trigger Loop (TL) genannt, welches eine wichtige Rolle spielt in der Elongationsphase der Transkription. Wir haben ein rekonstituiertes in vitro Transkriptionssystem des Archaeons Pyrococcus furiosus genutzt zur Charakterisierung verschiedener TL Deletionsmutanten sowie der Alanin-Substitutionsmutanten für drei funktionell entscheidende Aminosäurereste (A” Q80, A” L83 und A” H87). Ausserdem wurden vier weitere TL Mutanten untersucht bezüglich ihrer Rolle bei der Unterscheidung von NTP und 2’dNTP.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass der archaeale TL eine absolut essentielle Rolle spielt während der Transkriptionsinitiation, besonders zur Bindung der ankommenden Nukleotide bevor ein stabiler DNA-RNA Hybrid im aktiven Zentrum geformt wurde. Ausserdem spielt der TL eine entscheidende Rolle bei der Katalyse, bei der Schliessung des aktiven Zentrums, und bei der Stimulierung der Synthese in Initial-Transkriptionskomplexen. Im Besonderen A” H87 und die Spitze des TL waren essentiell für die Transkriptionsinitiation.
In vitro Transkriptionselongationsexperimente verschafften auch Einsicht in die Rolle des TL bei der Unterscheidung zwischen dem korrekten Substrat NTPs und dNTPs. A” L83 und A” H87 tragen zur Erkennung von NTPs sowie zur Katalyse bei, während A” Q80 speziell zur die Erkennung der 2’OH-Gruppe der NTPs beiträgt. Dieses Resultat unterstreicht die Bedeutung der Interaktion zwischen TL und NTP bei der Inkorporation von NTPs in Bezug auf die Ablesegenauigkeit.
Eine hohe Ablesegenauigkeit bei der Transkription ist auch Korrekturlesung durch die RNAP abhängig. Dieser Mechanismus findet nach der Inkorporation des NTPs statt und beinhaltet den endonukleolytischen Verdau eines Dinukleotids, das das fehlerhaft eingebaute Nukleotid enthält, vom 3’ Ende der RNA. Der TL wird nicht benötigt für die intrinsische Endonuklease-Aktivität, jedoch beinflusst er die Translokation der RNAP, da er Teil des sogenannten “Brownian Ratchet”-Mechanismus (“Brownsche Ratsche”) ist, welcher der Translokation zugrunde liegt. Die hier präsentierten Daten zeigen die kritische Rolle des TL Aminosäurerestes A” L83 in der Stabilisierung von RNA Polymerasen in der sogenannten “backtracked” Form auf. Der endonukleolytische Verdau während der Korrekturlesung wird stimuliert durch extrinsiche Faktoren wie z.B. TFS. Wir zeigen das der TL nicht benötigt wird für den durch TFS stimulierten RNA-Verdau, was unterstützt wird durch Kristallstrukturen, die zeigen, dass der TL blockiert ist wenn TFIIS, das eukaryontische TFS Homolog, an die RNA Polymerase gebunden hat.
Zum Schluss zeigen wir auch, dass der TL eine Rolle bei der Transkriptionstermination spielt. Die Sensitivität der archäalen RNA Polymerase für Poly-T Sequenzen ist erhöht in TL-Deletionsmutanten der RNAP. Dies zeigt, dass der TL die aberrante Transkriptionstermination verhindert und dadurch die Prozessivität der RNAP erhöht.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 01:39
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