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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-295899
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.29589
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 12 März 2014 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Tag der Prüfung: | 28 Februar 2014 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmazeutische / Medizinische Chemie II (Prof. Buschauer) |
| Stichwörter / Keywords: | ABCG2 modulators, ATPase, ABCG2 inhibition |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 29589 |
Zusammenfassung (Englisch)
Multidrug transporter proteins such as ABCB1, ABCC1 and ABCG2 are known to contribute the chemoresistance of malignant tumors. Expression of these transporters by cancer cells leads to an efflux of anticancer drugs. The inhibition of efflux pumps, namely ABCB1, has been explored in clinical trials to overcome ABC transporter mediated drug resistance in cancer patients, but did not lead to a drug ...
Zusammenfassung (Englisch)
Multidrug transporter proteins such as ABCB1, ABCC1 and ABCG2 are known to contribute the chemoresistance of malignant tumors. Expression of these transporters by cancer cells leads to an efflux of anticancer drugs. The inhibition of efflux pumps, namely ABCB1, has been explored in clinical trials to overcome ABC transporter mediated drug resistance in cancer patients, but did not lead to a drug approval. The limitations of this approach can be explained by multiple resistance mechanisms including the contribution of ABC transporters other than ABCB1. The relevance of ABCG2 inhibition has not been adequately explored.
Apart from chemoresistance in cancer, ABC transporters play a major role as efflux pumps expressed in epithelia and endothelial cells, influencing the bioavailability, tissue distribution and the excretion of drugs. In particular, modulation of ABC transporters at the blood brain barrier (BBB) may considerably increase the entry of drugs into the central nervous system (CNS) and enhance the effectiveness of pharmacotherapy, including the chemotherapy of malignancies in the CNS, as demonstrated in a proof-of-concept study in mice with paclitaxel in combination with the ABCB1 modulator valspodar. This strategy should even be more effective in case of inhibition of ABCG2, as this transporter is considered to be the most important efflux transporter at the BBB. To prove this hypothesis, potent and selective ABCG2 modulators are required.
This doctoral project was pursued in collaboration with Prof. Dr. B. König (Institute of Organic Chemistry, University of Regensburg), aiming at the development of selective ABCG2 modulators. Previously reported quinoline carboxamide-type compounds from our laboratory were highly potent and selective ABCG2 modulators, but revealed unfavourable physico-chemical properties due to poor solubility and rapid enzymatic cleavage of a central benzamide bond. Next generation inhibitors were characterized in various functional assays (Hoechst 33342, calcein-AM, pheophorbide a, kinetic cytotoxicity assay) available in our laboratory. Additional in vitro models for the characterization of the transporter inhibitors were established (mitoxantrone microplate assay for ABCG2, ABCG2-ATPase assay using Sf9 membranes), the selectivity for ABCG2 compared to ABCB1 and ABCC1 was determined, and (bio)analytical studies (plasma protein binding by ultrafiltration, equilibrium dialysis, isothermal titration calorimetry and HPLC; stability against enzymatic cleavage) were performed.
Preliminary preclinical studies in nude mice bearing orthotopically implanted genetically modified human glioblastoma enabling optical in vivo imaging, proved that U-87MG xenografts grow rapidly in the brain. However, these tumors were too aggressive to perform therapeutic studies. Therefore, in search for a more appropriate tumor entity, three malignant human brain tumor cell lines (Daoy, LN 18, SW 1783) were characterized regarding growth kinetics, chemosensitivity against several anti-cancer drugs, and ABC transporter expression as well as tumorigenicity in a subcutaneous tumor model in nude mice.
Bioisosteric replacement of the central amide core of the first and second generation of ABCG2 inhibitors by a biphenyl, quinoline, indol or triazole moiety resulted in chemically more stable compounds, and the introduction of triethyleneglycol residues increased solubility. In the new compound libraries dual ABCB1/ABCG2 and ABCG2-selective modulators were identified which are among the most potent BCRP inhibitors reported so far (IC50 in the two-digit nM range).
Selected ABCG2 modulators were additionally investigated in an in vitro model of the BBB (porcine brain capillary endothelial cell layer, expressing ABCG2; cooperation with Prof. H. J. Galla, University of Münster) to get closer to the physiological situation and to predict the influence of the compounds on the penetration of co administered drugs into the brain of nude mice bearing orthotopically growing xenografts. Surprisingly, in the BBB model the investigated inhibitors were much more potent than in the fluorescence based assays.
The reduced transport of a substrate used to determine ABCG2 activity in the presence of a modulator may result from different modes of action: competition of the test compound with the indicator as a substrate or inhibition of the transport. To discriminate between the mechanisms of modulation, a colorimetric ATPase assay in the microplate format was established using membrane preparations from baculovirus-infected Sf9 cells expressing the human ABCG2 protein. All tested compounds turned out to be ‘true’ ABCG2 inhibitors, capable of inhibiting substrate-induced ATPase activity.
In summary, the new ABCG2 modulators were highly potent inhibitors, but showed poor water solubility and very high plasma protein binding (almost 100%). The drug-like properties of these compounds have to be further improved in view of in vivo studies
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
ABC Transporter wie ABCB1, ABCC1 und ABCG2 tragen wesentlich zur Ausbildung von Chemoresistenzen maligner Tumore bei. Zahlreiche therapeutisch relevante Zytostatika sind Substrate dieser Transporter. Die Expression der Transporter in der Membran von Krebszellen führt zu einem verstärkten Efflux der entsprechenden Wirkstoffe und bedingt den Phänotyp der Multidrug Resistenz, was die Effektivität ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
ABC Transporter wie ABCB1, ABCC1 und ABCG2 tragen wesentlich zur Ausbildung von Chemoresistenzen maligner Tumore bei. Zahlreiche therapeutisch relevante Zytostatika sind Substrate dieser Transporter. Die Expression der Transporter in der Membran von Krebszellen führt zu einem verstärkten Efflux der entsprechenden Wirkstoffe und bedingt den Phänotyp der Multidrug Resistenz, was die Effektivität der Krebschemotherapie stark einschränkt.
Physiologischerweise bilden ABC Transporter, die in verschiedenen Epithelzellen exprimiert werden, Barrieren für eine Vielzahl chemischer Substanzen, einschließlich zahlreicher Arzneistoffe, was deren Bioverfügbarkeit, Gewebeverteilung und Ausscheidung beeinflusst. An der Blut-Hirn-Schranke (BHS) verhindern ABC-Transporter die Penetration bestimmter Arzneistoffen ins zentrale Nervensystem. Die Modulation von ABC Transportern an der BHS stellt daher eine attraktive Strategie dar, um die Aufnahme therapeutisch wichtiger Substanzen ins Gehirn zu erhöhen, beispielsweise um dadurch die Chemotherapie von intrazerebralen Tumoren zu verbessern. In diesem Zusammenhang ist die Hemmung des ABCG2 Transporters (BCRP) besonders interessant, dem als Effluxpumpe in den Endothelzellen der Kapillaren der BHS eine wichtige Rolle zugeschrieben wird.
Diese Arbeit entstand in Kooperation mit dem Institut für Organische Chemie (Prof. Dr. B. König) mit der Zielsetzung, selektive ABCG2 Modulatoren zu entwickeln. Durch strukturelle Modifikationen am ABCB1 Modulator Tariquidar konnten unlängst in unserer Arbeitsgruppe potente und selektive ABCG2 Inhibitoren identifiziert werden, mit UR-ME22-1 als potentestem Vertreter. Stabilitätstests unter physiologischen Bedingungen zeigten, dass Vertreter dieser Substanzklasse innerhalb kürzester Zeit am zentralen Benzamid-Teil enzymatisch gespalten werden. Zudem war die Wasserlöslichkeit dieser Verbindungen extrem gering. Durch die Einführung von Triethylenglykol-Ketten wurde die Löslichkeit verbessert und die maximale Hemmung gesteigert. Verschiedene Biosisosterie-Ansätze führten über den Ersatz des zentralen Benzamid-Teils durch Biphenyl-, Indol-, Triazol- oder Chinolin-Partialstrukturen zur Erhöhung der Stabilität.
Die neuen Substanzen wurden in verschiedenen funktionellen zellulären Assaysystemen als ABCG2-Modulatoren charakterisiert. Neben bereits vorhandenen Assays (Hoechst 33342-, Calcein-AM-, Pheophorbid a-, kinetischer Chemosensitivitäts-Assay) kamen dabei weitere, im Rahmen dieser Arbeit etablierte in-vitro-Modelle (Mitoxantron- und ABCG2-ATPase-Assay im Mikrotiterplattenformat) zum Einsatz. Die Untersuchung der ABCG2-Selektivität der Substanzen erfolgte im Vergleich zu ABCB1 und ABCC1, und es wurden bioanalytische Studien im Hinblick auf Plasmaproteinbindung und chemische Stabilität durchgeführt. Daneben wurden drei maligne Hirntumorzelllinien (Daoy, LN 18 und SW 1783) hinsichtlich Wachstum, Chemosensitivität gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika, ABC Transporter Expression sowie Tumorigenität in Nacktmäusen untersucht, um weitere subkutane und orthotope In-vivo-Tumormodelle für humane Glioblastome zu etablieren.
In Stabilitätsuntersuchungen unter physiologischen Bedingungen zeigte sich, dass durch den Austausch des hydrolyseempfindlichen Amids die Stabilität im Vergleich zu den Substanzen der vorhergehenden Generation wesentlich erhöht werden konnte. Unter diesen neuen Verbindungen wurden sowohl selektive ABCG2 als auch duale ABCG2/ABCB1 Modulatoren identifiziert, die zu den potentesten derzeit bekannten Hemmstoffen gehören (IC50-Werte im zweistelligen nM-Bereich).
Um im Hinblick auf geplante Untersuchungen in einem orthotopen Xenotransplantat-Modell in Nacktmäusen den Einfluss der Modulatoren auf die Hirngängigkeit von Arzneistoffen besser einschätzen zu können, wurden ausgewählte Verbindungen in-vitro in einem ABCG2-BHS-Modell getestet (Kooperation mit Prof. H. J. Galla, Universität Münster). In diesem Modell (Monolayer aus Endothelzellen aus Schweinhirnkapillaren) erwiesen sich die entwickelten Substanzen im Vergleich zu fluoreszenzbasierten zellulären Assays als deutlich potenter.
Die Frage, ob die entwickelten Verbindungen „echte“ Inhibitoren oder ABCG2-Substrate sind, konnte mit Hilfe des etablierten ATPase Assays (ABCG2-exprimierende Sf9 Insektenzell-Membranen) beantwortet werden: Alle getesteten Verbindungen wurden als ABCG2 Inhibitoren identifiziert. Die weitere Charakterisierung der Verbindungen bezüglich Bioverfügbarkeit und Plasmaproteinbindung mittels Ultrafiltration, Dialyse, Kalorimetrie oder fluoreszenzbasierten Methoden gestaltete sich aufgrund der hohen Lipophilie und der äußerst geringen Wasserlöslichkeit der Verbindungen als schwierig. Auf der Basis spezieller HPLC Methoden wurde eine Proteinbindung von >98% berechnet.
Die neuen ABCG2-Inhibitoren erwiesen sich in vitro als hoch potent und selektiv. Die arzneistoffartigen Eigenschaften dieser Verbindungen müssen jedoch im Hinblick auf In-vivo-Studien weiter verbessert werden.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 01:22
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