| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (13MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-305102
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.30510
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 4 August 2015 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Anja-Katrin Boßerhoff und Prof. Dr. Klaus von der Mark und Prof. Dr. Ernst Tamm |
| Tag der Prüfung: | 27 Juni 2014 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Pathologie |
| Stichwörter / Keywords: | cartilage, AP-2 epsilon, osteoarthritis |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 30510 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Gegenstand der vorliegenden Dissertation ist die Analyse der Bedeutung des Transkriptions-faktors AP-2 epsilon (AP-2ε) in Chondrozyten. Auf diese Weise soll zum besseren Verständnis von molekularen Prozessen bei der Entwicklung und der Homöostase von Knorpelgewebe sowie bei der Entstehung einer Osteoarthrose beigetragen werden. Anfängliche Studien unserer Arbeitsgruppe konnten die Expression von ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Gegenstand der vorliegenden Dissertation ist die Analyse der Bedeutung des Transkriptions-faktors AP-2 epsilon (AP-2ε) in Chondrozyten. Auf diese Weise soll zum besseren Verständnis von molekularen Prozessen bei der Entwicklung und der Homöostase von Knorpelgewebe sowie bei der Entstehung einer Osteoarthrose beigetragen werden.
Anfängliche Studien unserer Arbeitsgruppe konnten die Expression von AP-2ε in ver¬schiedenen chondrozytären Zelltypen belegen. Allerdings gab es keine weiterreichenden Informationen über die Funktion von AP-2ε in Knorpelzellen. Über einen ChIP-on-Chip-Ansatz konnte das Gen für das Chemokin CXCL1 als potentielles Zielgen von AP-2ε in humanen Chondrozyten identifiziert werden. Dies wurde anhand einer detaillierten Studie des CXCL1 Promotors bestätigt. Über Reportergen- und Mutagenese-Experimente konnte eine spezifische AP-2 Bindestelle im CXCL1 Promotor ausfindig gemacht werden, über welche AP-2ε die Expression des Gens fördert. Die direkte Bindung von AP-2ε an dieses Sequenzmotiv ließ sich über Gelshift-Versuche und eine Chromatin-Immunpräzipitation verifizieren. Umgekehrt konnte bei ähnlicher experimenteller Vorgehensweise eine inhibitorische Wirkung von AP-2ε auf das Gen für Typ II Kollagen (COL2A1) festgestellt werden. Auch dies erfolgt über ein einzelnes Bindemotiv in der proximalen COL2A1 Promotorsequenz. Es ließ sich also zeigen, dass AP-2ε in humanen Chondrozyten die Transkriptionsrate von CXCL1 positiv und von COL2A1 negativ moduliert.
Trotz dieser regulatorischen Funktionen haben adulte AP-2ε defiziente Mäuse (Tfap2e -/-) keinen offensichtlich anormalen Phänotyp. Aus diesem Grund wurde im zweiten Teil dieser Arbeit die embryonale Skelettentwicklung der Tiere über in situ Hybridisierungen sowie über Differenzierung isolierter mesenchymaler Zellen im Detail untersucht. Hierbei war es das Ziel transiente Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp (WT) aufzudecken, welche Rückschlüsse bezüglich der Rolle von AP-2ε bei der Knorpel- und Skelettentwicklung zulassen würden. Dabei ließen sich bei den Tfap2e -/- Embryonen aber keine bis lediglich geringe Anormalitäten feststellen, was auf redundante Kompensations¬mechanismen hinweist, die den Verlust von AP-2ε ausgleichen. Nichtsdestotrotz konnte im Rahmen dieser Analyse gezeigt werden, dass AP-2ε in WT Mäusen bereits in den frühen mesenchymalen Extremitätenknospen nachweisbar ist, aber das Expressionslevel noch weit unter dem von differenzierten Chondrozyten liegt.
Im Fokus der weiteren Arbeiten stand deshalb die Identifikation von regulatorischen Mechanismen, die für die Induktion der AP-2ε Expression im Verlauf der Chondrozyten-differenzierung verantwortlich sind. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die Expression von AP-2ɛ in Knorpelzellen durch den Transkriptionsfaktor HIF-1α gefördert wird. Dessen Aktivität ist wiederum stark von der relativen Sauerstoffkonzentration im Gewebe abhängig, was Hypoxie als potentiellen Induktor der AP-2ε Expression auswies. Die Korrelation der AP-2ε Expression mit der des Hypoxiemarkers Angptl4 sowie die Inkubation von Chondrozyten bei 1 % atmosphärischer Sauerstoffkonzentration und die Behandlung von Zellen mit den Hypoxie-simulierenden Eisenchelatoren DP bzw. DFX bestätigten dies.
Abschließend wurde der Einfluss von AP-2ε auf die Homöostase sowie auf patho-physiologische Veränderung des adulten Gelenkknorpels untersucht. Dazu wurden Tfap2e -/- und WT Mäuse einem Osteoarthrose-Modell unterzogen und die Progression der Erkrankung in beiden Genotypen verglichen. Interessanterweise konnte bei den AP-2ε defizienten Mäusen eine signifikant verstärkte Ausprägung der Krankheit beobachtet werden. Über immun-histochemische Färbungen gegen Cleaved Caspase 3 konnte ausgeschlossen werden, dass eine erhöhte Apoptoserate im Knorpel der Tfap2e -/- Tiere kausal dafür verantwortlich ist. Überraschenderweise ließ sich hingegen eine deutlich erhöhte Grundexpression sowie -aktivität des katabolen Enzyms Mmp13 im artikulären Knorpel der Tfap2e -/- Mäuse detektieren. Hieraus kann gefolgert werden, dass AP-2ε die Expression von Mmp13 in artikulären Chondrozyten negativ reguliert und es deshalb nach einer Deletion des Transkriptionsfaktors zu einer Zunahme der Mmp13 Expression kommt. Sehr wahrscheinlich verschiebt sich hierdurch das physiologische Gleichgewicht aus Matrix-Degradation und -Neusynthese auf die katabole Seite, was auf Dauer zu einer Störung der Funktionalität und Integrität des artikulären Knorpels führt. Wie aus dem Osteoarthrose-Modell hervorging, äußert sich dies bei den AP-2ε defizienten Mäusen in einer erhöhten Suzeptibilität des Gewebes gegenüber einer Überlastung sowie einer stärkeren Schädigung des Gewebes unter pathophysiologischen Bedingungen.
Insgesamt konnte also zum ersten Mal in vitro und in vivo gezeigt werden, dass AP-2ε an der Regulation der Genexpression in Chondrozyten beteiligt ist und die Entstehung und Progression einer Osteoarthrose maßgeblich beeinflusst.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Subject of the present dissertation is a detailed analysis of the functional role of the transcription factor AP-2 epsilon (AP-2ε) in chondrocytes. Hereby, a better understanding of molecular processes implicated in the morphogenesis and the homeostasis of cartilage as well as osteoarthritis (OA) development shall be achieved. Initial studies in our group revealed expression of AP-2ε in various ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Subject of the present dissertation is a detailed analysis of the functional role of the transcription factor AP-2 epsilon (AP-2ε) in chondrocytes. Hereby, a better understanding of molecular processes implicated in the morphogenesis and the homeostasis of cartilage as well as osteoarthritis (OA) development shall be achieved.
Initial studies in our group revealed expression of AP-2ε in various cartilaginous cell types, however, there was no further information about the function of AP-2ε in cartilage. Based on a ChIP-on-Chip approach the gene for the chemokine CXCL1 could be identified as a potential AP-2ε target gene in human chondrocytes. This was verified via an in-depth analysis of the CXCL1 promoter by means of reporter gene assays and site directed mutagenesis. This way, a specific AP-2 binding site within the CXCL1 promoter sequence could be identified which is responsible for the AP-2ε mediated induction of CXCL1 expression. Direct binding of the transcription factor to this motive was confirmed by gel shift assays and chromatin immunoprecipitation. Conversely, utilizing similar experimental procedures an inhibitory effect of AP-2ε on the gene for type 2 collagen (COL2A1) could be determined. This also is mediated by a single motive in the proximal COL2A1 promoter region. Thus, it was shown that AP-2ε is a positive regulator of CXCL1 and a negative regulator of COL2A1 expression in human chondrocytes.
Despite these regulatory functions, adult mice deficient for AP-2ε (Tfap2e -/-) do not exhibit an apparent abnormal phenotype. Therefore, in the second part of this work embryonic skeletal development of these animals was carefully examined via in situ hybridization against cartilage marker genes as well as micro mass differentiation of isolated mesenchymal limb bud cells. The objective was to uncover transient abnormalities compared to the wild type (WT) which would have allowed for implications concerning the role of AP-2ε in cartilage and skeletal development. However, no major discrepancies could be determined in Tfap2e -/- embryos suggesting that redundant compensatory mechanisms offset the loss of AP-2ε during embryogenesis. Nevertheless, the experiments revealed that AP-2ε is already detectable in early mesenchymal limb buds of WT mice but the level of expression is far below differentiated chondrocytes.
Based on this, identification of regulatory mechanisms responsible for the induction of AP-2ε expression during chondrocyte differentiation was in focus of further studies. Using siRNA technique it was shown that expression of AP-2ε in chondrocytes is positively modulated by the transcription factor HIF-1α. In turn, activity of HIF-1α is heavily dependent on low oxygen concentrations in the surrounding tissue which suggested hypoxia to be an inductor of AP-2ε expression. This was confirmed via incubation of chondrocytic cells at 1 % atmospheric oxygen and treatment with the hypoxia-simulating iron chelators DP and DFX as well as a close correlation between the expression pattern of AP-2ε and the characteristic hypoxia marker Angplt4 in different samples types.
Finally, possible roles of AP-2ε in the homeostasis of adult articular cartilage as well as during pathophysiological alterations of the tissue were examined. In doing so, Tfap2e -/- and WT mice were subjected to an in vivo osteoarthritis model and progression of the disease was analyzed in both genotypes. Strikingly, OA progression was significantly enhanced in AP-2ε deficient mice compared to WT mice 17 days after disease onset. Immunohistochemistry for cleaved caspase 3 suggested that increased apoptosis in cartilage of the Tfap2e -/- animals is not responsible for this observation. Surprisingly though, basal expression as well as activity of the catabolic enzyme Mmp13 was significantly higher in articular cartilage of Tfap2e -/- mice. Hence, it can be concluded that AP-2ε negatively regulates Mmp13 expression in articular chondrocytes and thus deletion of the transcription factor in Tfap2e -/- mice is accompanied with the observed increase of Mmp13 expression. Most likely, due to AP-2ε depletion the physiological balance between matrix degradation and synthesis normally present in articular cartilage shifts to the catabolic side which in the long run results in disruption of tissue functionality and integrity. As determined from the OA model, this manifests in an elevated susceptibility of the Tfap2e -/- cartilage to overload and increased tissue damage under pathophysiological conditions.
Taken together, for the first time it was shown in vitro and in vivo that AP-2ε is involved in the regulation of gene expression in chondrocytes and markedly influences osteoarthritis progression in mice.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 00:54
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