| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (89MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-324823
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.32482
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 16 September 2016 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Dr. Hans-Robert Kalbitzer |
| Tag der Prüfung: | 16 September 2015 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Stichwörter / Keywords: | Zonula occludens 1, Afadin 6, H-Ras, Rap1A, interaction |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 32482 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die Aufklärung der Interaktionsprozesse zwischen der Ras-Assoziations-Domäne 1 des Afadin 6 Proteins und den kleinen GTPasen Rap1A und H-Ras mit NMR-spektroskopischen Methoden. Afadin 6 ist eines der Hauptgerüstproteine der Adherens Junctions und an der Ausbildung und Aufrechterhaltung der Nectin-vermittelten Zell-Zell-Kontakte beteiligt. Die kleinen GTPasen ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die Aufklärung der Interaktionsprozesse zwischen der Ras-Assoziations-Domäne 1 des Afadin 6 Proteins und den kleinen GTPasen Rap1A und H-Ras mit NMR-spektroskopischen Methoden. Afadin 6 ist eines der Hauptgerüstproteine der Adherens Junctions und an der Ausbildung und Aufrechterhaltung der Nectin-vermittelten Zell-Zell-Kontakte beteiligt. Die kleinen GTPasen H-Ras und Rap1A, die beide zur Unterfamilie der Ras-GTPasen gehören, fungieren in der Zelle durch alternierende Bindung der Nukleotide GDP und GTP als molekulare Schalter. Beide sind Teil diverser Signaltransduktionskaskaden, wie dem RTK- (Rezeptor-Tyrosin-Signalkaskade) oder dem JAK/STAT-Signalweg (Januskinase and signal transducers and activators of transcription), und haben durch ihre Schalterfunktion einen gravierenden Einfluss auf Differenzierungs- und Wachstumsprozesse der Zellen. Die Interaktion des Afadin 6 mit den kleinen GTPasen Rap1A und H-Ras war bereits bekannt, jedoch konnten die molekularen Interaktionsmechanismen dieser Komplexbildung bis dato nicht vollständig aufgeklärt werden. Im Zuge dieser Arbeit jedoch konnten diese Komplexbildungen von Seiten des 15N-Isotop markierten Afadin 6 während diverser HSQC-NMR-Titrationsreihen mit den unmarkierten GTPasen in verschiedenen Nukleotid-Beladungszuständen auf atomarer Ebene verfolgt werden. Hierbei stellte sich heraus, dass der kanonische Bindebereich der Afadin 6 Ras-Assoziations-Domäne 1 als gemeinsamer Interaktionsbereich beider GTPasen fungiert. Dieser umfasst die aktiv an der Bindung beteiligten Aminosäuren C59, T57, F55, N54, G53 und A52 des β2-Faltblattes[N54 bis V62], sowie die Aminosäuren E77, K78, F79, R80, M83 und R84 der α3-Helix[T67 bis F79] und der angrenzenden Loop-Region. Zusätzlich konnten die gravierenden Unterschiede beider Komplexe in Bezug auf ihre Effektor-Spezifität detailliert charakterisiert werden. Dabei zeigte sich, dass die GTPase H-Ras an Position 31 ein Glutamat (E) trägt, im Gegensatz zu Rap1A, welches an Position 31 über ein Lysin (K) verfügt. Dieser Unterschied führt dazu, dass H-Ras eine Salzbrücke zwischen dem E31 und dem K78 des Afadin 6 ausbildet, Rap1A allerdings in der Lage ist diese Salzbrücke über die Aminosäure K31 mit dem benachbarten E77 des Afadin 6 auszubilden. Infolgedessen kommt es bei der Komplexbildung des Afadin 6 mit Rap1A zu einer Drehung des Rap1As, was bei H-Ras nicht der Fall ist. Durch diese Drehung ist Rap1A zusätzlich durch die Aminosäuren seiner Switch II Region in die Bindung involviert. Diese interagieren mit den Aminosäuren H18, H19, W20 und D26 der α1-Helix, sowie deren an-grenzende Loop-Region, des Afadin 6. Diese Tatsache kann die höhere Affinität des Rap1A im Vergleich zu H-Ras an die RA1-Domäne des Afadin 6 erklären. Ebenso konnte ein interessanter Bindungseffekt im C-terminalen Bereich der Afadin 6 Ras-Assoziations-Domäne 1 festgestellt und näher charakterisiert werden. Dieser Bereich umfasst die Aminosäuren E131, N132, D133 und A134 des AF6-RA1-Konstruktes. Die Funktion dieser zusätzlichen Interaktion konnte jedoch noch nicht aufgeklärt werden.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktion des Afadin 6 mit dem Zonula occludens 1 Protein anhand biochemischer und NMR-spektroskopischer Methoden zu charakterisieren. Das Zonula occludens 1 Protein ist das Hauptgerüstprotein einer weiteren Klasse von Zell-Zell-Kontakten, den sogenannten Tight Junctions. Afadin 6 kommt in diesen Tight Junctions nicht vor, Zonula occludens 1 jedoch maßgeblich nur in den Tight Junctions. Beide Proteine scheinen während der Ausbildung neuer Zell-Zell-Kontakte colokalisiert vorzuliegen und scheinen im Verlauf dieser zellulären Prozesse, in einer noch ungeklärten wechselseitigen Beziehung zueinander zu stehen. Durch die Analyse dieser Komplexbildung von Seiten des 15N-markierten Afadin 6 aus mit der homodimeren PDZ2-Domäne und einer monomeren Mutante dieser Domäne konnte die Interaktion schließlich NMR-spektroskopisch auf die Wildtyp-PDZ2-Domäne des Zonula occludens 1 reduziert und daraufhin charakterisiert werden. Im Falle der Interaktion des Afadin 6 mit der PDZ2-Domäne des Zonula occludens 1 zeigten sich hierbei gravierende Übereinstimmungen mit den Interaktionsbereichen des Afadin 6-Rap1A-Komplexes. Hierbei scheint vor allem der Teilbereich E77 bis D82, der kanonischen Bindeposition, von großem Interesse zu sein. Dieser ist homolog zur bekannten Connexin43-Erkennungssequenz der PDZ2- Domäne des Zonula occludens 1 und kann so die Interaktion des Afadin 6 mit Zonula occludens 1 teilweise erklären.
Zusätzlich konnten die NMR-HSQC-Signale von Seiten der Zonula occludens Konstrukte PDZ2 und PDZ2-MUT2, durch HNCO-, HNCA- und CBCACONH-NMR-Experimente sequentiell zugeordnet werden und stehen nun für eine reziproke Untersuchung der Interaktionsfläche zur Verfügung.
Anhand der Analysen der Interaktionen des Zonula occludens 1, sowie der GTPasen H-Ras und Rap1A, konnten diese letztendlich über den Bindepartner Afadin 6 in einen gemeinsamen physiologischen Kontext gestellt werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
One aim of this thesis was to study the interaction between the Ras-association-domain 1 of the protein Afadin 6 (AF6-RA1) and the small GTPases H-Ras and Rap1A with nuclear magnetic resonance (NMR) based methods. Afadin 6 is one of the main scaffold proteins present in adherens junctions and is important for the formation and maintenance of these Nectin-mediated cell-cell contacts. The small ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
One aim of this thesis was to study the interaction between the Ras-association-domain 1 of the protein Afadin 6 (AF6-RA1) and the small GTPases H-Ras and Rap1A with nuclear magnetic resonance (NMR) based methods. Afadin 6 is one of the main scaffold proteins present in adherens junctions and is important for the formation and maintenance of these Nectin-mediated cell-cell contacts. The small GTPases H-Ras and Rap1A can switch their activity, based on their nucleotide loading and therefore serve as a molecular switch mediator in the cell. Both of them are part of various signal transduction pathways like the RTK- (Receptor tyrosine kinases) or the JAK/STAT- (Januskinase and signal transducers and activators of transcription) pathway. Based on their function as molecular switches they influence differentiation and proliferation of the cells. The interaction of Afadin 6 and these small GTPases was already known, but the molecular mechanism how this interaction takes place, is not completely understood yet. During this work it was possible to investigate the complex formation of 15N-labeled AF6-RA1 with the unlabeled GTPases through NMR titration experiments on an atomic scale. Thereby it was founded, that both GTPases share the same canonical binding area on the AF6-RA1 protein. This area includes the amino acids C59, T57, F55, N54, G53 and A52 of the β2-sheet[N54 to V62] and the amino acids E77, K78, F79, R80,M83 and R84 of the α3-helix[T67 to F79] as well as the adjacent loop region. Furthermore some specific differences between the AF6-RA1 and H-Ras as well as the AF6-RA1 and Rap1A complex could be identified. Thus H-Ras carries a glutamate at position 31, while Rap1A carries a lysine at this position. This difference leads to the formation of a salt bridge between H-Ras-E31 and AF6-K78, whereas in the case of Rap1A a salt bridge between Rap1A-K31 and AF6-E77 is formed. The result of this difference is a rotation of the Rap1A protein compared to the H-Ras protein in their complexes. This leads to an interaction of the amino acids H18, H19, W20 and D26 of the α1-helix and the adjacent loop region of AF6-RA1 with the switch II region of Rap1A. Hence the higher affinity of Rap1A towards AF6 compared to H-Ras towards AF6 can be explained. Also there are some interesting binding events in the C-terminal region (E131, N132, D133 and A134) of the AF6-RA1 whose function couldn’t be solved yet. The second aim of this thesis was to minimize the area of interaction between the proteins Afadin 6 and Zonula occludens 1 using biochemical and NMR-spectroscopic methods. The Zonula occludens 1 protein only occurs in tight junctions while Afadin 6 seems to be excluded from those. Apart from this strict separation both proteins appear to be co-localized when new cell-cell contacts are developed. The investigation of the complex formation between 15N-AF6-RA1 and the PDZ2-domain of Zonula occludens 1 and between AF6-RA1 and a monomeric version (MUT2) of this homodimeric PDZ2-domain using NMR-spectroscopy, leads to the exact localization of the interaction domain. Thus it was found that AF6-RA1 interacts with the wild type, dimeric PDZ2-domain, but not with the monomeric mutant. Interestingly this interaction is highly similar to the molecular interaction of AF6-RA1 and Rap1A. The most important regions seem to be the canonical part, E77 to D82, of the AF6-RA1, which is homologous to the already known binding motif of Connexin43 with the PDZ2 domain of Zonula occludens 1. This area might be able to initiate the complex formation between Afadin 6 and the Zonula occludens 1 protein. Additionally it was possible to sequentially assign the HSQC-signals of the PDZ2 and the monomeric MUT2 version and to characterize their biochemical features. Therefore the interaction of Afadin 6 with Zonula occludens 1 from an inverse point of view has to be analyzed in future projects, to validate this knowledge. The investigation of the complex formation between Zonula occludens 1, H-Ras and Rap1A with their coincident binding partner Afadin 6 provides some interesting insights into the physiological context of these proteins.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 23:32
Nur für Besitzer und Autoren: Kontrollseite des Eintrags
Downloadstatistik