Zusammenfassung (Deutsch)
Zur Erforschung der chronischen Hepatitis B-Infektion werden oftmals stabil mit dem HB-Virus infizierte Zellkulturen verwendet. Es stellt sich aber die Frage, ob dieses in - vitro Modell ein Ersatz für eine in - vivo Infektion darstellen kann. Ausgehend von dieser Fragestellung erfolgte die Betrachtung der durch die Versuche mit Hep G 2.2.15 Zellen erhaltenen Ergebnisse.
Zu Beginn der Arbeit ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Zur Erforschung der chronischen Hepatitis B-Infektion werden oftmals stabil mit dem HB-Virus infizierte Zellkulturen verwendet. Es stellt sich aber die Frage, ob dieses in - vitro Modell ein Ersatz für eine in - vivo Infektion darstellen kann. Ausgehend von dieser Fragestellung erfolgte die Betrachtung der durch die Versuche mit Hep G 2.2.15 Zellen erhaltenen Ergebnisse.
Zu Beginn der Arbeit stand die Aufgabe der Charakterisierung der Hepatomzelllinie
Hep G 2.2.15 durch quantitative Bestimmung der produzierten HBV-Komponenten über einen bestimmten Zeitraum. Zu diesem Zweck wurde neben der am Institut
vorhandenen Hep G 2.2.15 Zelllinie zusätzlich auf eine Hep G 2.2.15-Zellkultur aus einem weiteren Labor zurückgegriffen. Es konnte festgestellt werden, dass es zwar zu einem kontinuierlichen Anstieg – linear aber auch exponentiell – bei den HBVProteinen kam, sich diese Kulturen jedoch, was die Quantität an HBsAg und HBeAg
anging, stark unterschieden. Im Gegensatz dazu blieb die gemessene DNA-Kopienzahl über die Untersuchungsdauer hinweg für beide Kulturen relativ konstant.
Im Anschluss wurde der Einfluss rekombinanter humaner Zytokine, TNF α und IFN ɣ, in unterschiedlichen Konzentrationen und unter Modifikation der Versuchsbedingungen (Kulturdauer, Zeitpunkt der Zytokinzugabe, Zeitpunkt der Überstandsabnahme,
Zellkulturlinie) untersucht. Dabei konnte nicht in allen Versuchsreihen eine Auswirkung auf die Produktion von HBsAg und HBeAg detektiert werden. Eine nachweisbare Wirksamkeit auf die HBV-DNA konnte, trotz geringer Schwankungen in der Kopienzahl, nicht gezeigt werden. Dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu Ergebnissen in anderen Arbeiten, welche durchgängig, teilweise unter sehr ähnlichen Bedingungen, einen Effekt der beiden Zytokine nachweisen konnten.
Nach diesen Ergebnissen durch Zugabe technisch hergestellter Agentien, wurde der Effekt durch von naiven und spezifischen PBMC sezernierten Zytokinen getestet, die, durch eine semipermeablen Membran getrennt, in Kokultur mit einem Hep G 2.2.15 –Zellrasen kultiviert wurden. Dabei konnte sowohl für die PBMC geimpfter als auch ungeimpfter Spender eine ähnlich starke Reduktion von HBsAg und HBeAg im Vergleich zur Negativkontrolle nachgewiesen werden. Die Verringerung der Produktion
lag in etwa jeweils bei 50 %. Eine Auswirkung auf die HBV-DNA war wiederum nicht nachweisbar.
Zur Klärung des Einflusses unterschiedlicher Antikörper (humanes IgG, poly- und monoklonales Anti-HBs) wurden, wie bereits auch in den anderen Versuchsreihen,
unterschiedliche Konzentrationen dieser Agentien dem Medium beigefügt und kokultiviert mit dem Resultat, dass sowohl das humane IgG als auch der polyklonale
Antikörper eine Reduktion der HBeAg-Menge erreichen konnten. Nur in höheren Verdünnungen konnte das polyklonale Anti-HBs das HBeAg stärker verringern, bei
geringeren Verdünnungen ließ sich ein spezifischer Effekt des HBIG feststellen.
Die Unterschiede in der Handhabung der Zellkulturen, sowohl zwischen verschiedenen
Zelllinien als auch zwischen den Kulturen gleicher Zelllinien, die schwankenden
Ergebnisse von Versuchsreihen unter gleichen Rahmenbedingungen, sowie die
unzureichende Reproduzierbarkeit von Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen, stellen in
dieser Arbeit gefundene Gründe dar, weshalb sich durchaus noch eingehender mit der
Frage beschäftigt werden sollte, inwiefern das Modell der Hep G 2.2.15 als in vitro
Modell für eine chronische HB-Virus-Infektion stehen kann.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Hepatitis B-virus producing cell cultures are often used for the research on chronic hepatitis b infections. But the question is: can this in-vitro model replace in-vivo tests?
From this point of view we discuss the results of tests with Hep G 2.2.15 cell cultures.
At the beginning we measured the HBV components produced by Hep G 2.2.15 over several days. Besides the Hep G 2.2.15 cells of our ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Hepatitis B-virus producing cell cultures are often used for the research on chronic hepatitis b infections. But the question is: can this in-vitro model replace in-vivo tests?
From this point of view we discuss the results of tests with Hep G 2.2.15 cell cultures.
At the beginning we measured the HBV components produced by Hep G 2.2.15 over several days. Besides the Hep G 2.2.15 cells of our own institute, we also used Hep G 2.2.15 cells from another laboratory for comparison. We discovered in these tests that there was an increase – linear but also exponential – of the produced hepatits b proteins, but there was a huge difference of the quantities of HBsAg and HBeAg between the two used Hep G 2.2.15 cell lines. On the contrary the number of HBV-DNA was almost stable during the test time in both cell lines.
Then we studied the influence of several concentrations of human cytokines, TNF α and IFN ɣ, on the HBV producing cells under different conditions. We did not discover any significant effect of the cytokines in any of the tests. In fact there was more or less no influence on the production of HBV-DNA. This result is in contradiction to other published works, where tests under similar conditions are reported, and allegedly did show an effect on the used cytokines.
After obtaining these results we cocultured naïve and specific peripheral blood monocytes with the Hep G 2.2.15 cells which where separated by a semipermeable membrane. In this test we discovered a similar reduction of the production of HBV proteins by both – naïve and specific – PBMC. The decline was about 50%. And again there was no effect on the number of HBV-DNA.
Finally we tested the influence of different antibodies in different concentrations on the Hep G 2.2.15 cells. We found a reduction of HBeAg by the human IgG as well as by the polyclonal Anti-HBs. A strong effect of the polyclonal Anti-HBs on the HBeAg was only observed in higher degrees of dilution. There was an unspecific effect in lower degrees of dilution by the human IgG.
The differences in the individual treatment of the cell cultures, the unreproducible results in our own tests under identical conditions low reproducibility of the results compared to other published papers are reasons why further tests need to be done to answer the question if the HB-virus producing cell lines can actually serve as a model for a chronic hepatitis b infection.
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