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Reinigung und Charakterisierung zweier Matrix-Metalloproteinasen (VMP3 und VMP4) aus Volvox carteri f. nagariensis

URN to cite this document: urn:nbn:de:bvb:355-opus-797

Heitzer, Markus (2002) Reinigung und Charakterisierung zweier Matrix-Metalloproteinasen (VMP3 und VMP4) aus Volvox carteri f. nagariensis. PhD, Universität Regensburg

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Abstract (German)

Beim Übergang von der asexuellen in die sexuelle Lebensphase ist in der mehrzelligen, grünen Kugelalge Volvox carteri eine erhöhte Expression von zwei Genen (VMP3 und VMP4) zu beobachten, die starke Ähnlichkeit zu bekannten Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) zeigen, und deshalb als Volvox-Metalloproteinasen (VMPs) bezeichnet werden. Die Transkription der Gene erfolgt im Laufe der sexuellen Induktion ausschließlich in den somatischen Zellen. Mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern gegen in Escherichia coli heterolog exprimierte Teilbereiche von VMP3 und VMP4 konnte gezeigt werden, dass es sich bei den zugehörigen Genprodukten (VMP3 und VMP4) um hochmolekulare, stark glykosylierte Proteine (475 kDa bzw. 215 kDa) handelt, die in einem distinkten Bereich ('deep zone') der extrazellulären Matrix(ECM) der Alge lokalisiert sind. Beide Proteine konnten bis zur Homogenität gereinigt werden.
VMP3 zeigt in einem In-Gel-Assay (Zymographie) metallsalzabhängige Gelatinaseaktivität, die in ihrer Sensitivität gegenüber bekannten Proteaseinhibitoren mit der der MMPs übereinstimmt. Die enzymatische Katalyse von VMP3 verläuft - im Gegensatz zu allen bekannten Metalloproteasen - mit Cu(2+)-Ionen als Kofaktor sehr viel effektiver (Faktor 15) als mit Zn(2+)-Ionen. Durch die Einführung von Punktmutationen ins aktive Zentrum von VMP3 und homologe Expression der veränderten Gene in Volvox carteri selbst, konnte für den Glutaminrest (Q) des atypischen Metallbindemotivs der VMP-Proteine (QExxHxxGxxH statt HExxHxxGxxH, wie in den MMPs) eine Beteiligung an der bevorzugten Koordination des Cu(2+)-Ions nachgewiesen werden. Darüber hinaus sind sowohl das Glutamin (Q), als auch das Glutamat (E) des Metallbindemotivs für die Proteaseaktivität von VMP3 essentiell, unabhängig davon, welches Metallion als Kofaktor verwendet wird.

Translation of the abstract (English)

The multicellular, spheroidal green algae Volvox carteri mainly reproduces in a vegetative life cycle, but can also develop sexually. This 'sexual induction' is initiated by a pheromone. In response to the pheromone an enormous change in the pattern of gene expression of the somatic cells is detectable. Two of these genes, which are stimulated after sexual induction, encodes for the so-called Volvox-metalloproteinases 3 and 4 (VMP3 and VMP4). VMP3 and VMP4 are modular proteins with a domain homologous to matrix metalloproteinases (MMPs), but with a different putative metal binding motif (QExxHxxGxxH instead of HExxHxxGxxH). Small parts of the VMP3 and VMP4 gene were expressed heterologously in Escherichia coli to raise polyclonal antibodies. By means of these antibodies the corresponding proteins were localized within the 'deep zone' of the extracellular matrix (ECM) of adult Volvox spheroids. Both proteins were purified to homogeneity and turned out to be heavily glycosylated proteins with an apparent molecular mass of 475 kDa and 215 kDa, respectively.
In an in-gel-assay (zymography) VMP3 shows metal ion-depending gelatinase activity, with the enzyme being sensitive to the same set of protease inhibitors as the MMPs. In contrast to all known metalloproteinases, the enzymatic catalysis of VMP3 is much more effective by using Cu(2+)-ions as cofactor instead of Zn(2+)-ions. By introducing pointmutations within the metal binding motif of the VMP3 gene (QExxHxxGxxH instead of HExxHxxGxxH as in MMPs)and expressing the recombinant proteins homologously in Volvox carteri, it was shown, that the atypical glutamine residue (Q) is mainly responsible for the enzyme`s preference for Cu(2+). In addition this glutamine and the glutamate (E) within the binding motif are essential for the proteolytic activity of VMP3, independent of the metal ion used.

Item Type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Referee:	Armin Hallmann
Date of exam:	05 June 2002
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie
Keywords:	Volvox carteri , Grünalgen , Proteasen , Differentielle Genexpression , Glykoproteine , extrazelluläre Matrix , Metalloproteasen , Kupferenzyme , sexuelle Induktion , Volvox carteri , extracellular matrix , metalloproteinases , differential genexpression , copper-enzyme
Subjects:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Owner:	Universitätsbibliothek Regensburg
Deposited On:	21 Oct 2009 15:41
Last Modified:	22 Oct 2012 08:41
Item ID:	9924

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