Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Nef-Proteins aus HIV

Abstract (German)

In dieser Arbeit wurden strukturelle und funktionelle Eigenschaften des Nef-Proteins aufgeklärt und potentielle Interaktionspartner identifiziert. Es wurden sowohl HIV-1 Nef als auch das N-terminal um 57 aa verkürzte Nef-Core erfolgreich in Minimalmedium 15N-markiert und im mg-Maßstab mit einer Reinheit von >=95 isoliert. Das markierte Nef wurde in 15N-NMR-Messungen eingesetzt. In diesen ...

Abstract (German)

In dieser Arbeit wurden strukturelle und funktionelle Eigenschaften des Nef-Proteins aufgeklärt und potentielle Interaktionspartner identifiziert. Es wurden sowohl HIV-1 Nef als auch das N-terminal um 57 aa verkürzte Nef-Core erfolgreich in Minimalmedium 15N-markiert und im mg-Maßstab mit einer Reinheit von >=95 isoliert. Das markierte Nef wurde in 15N-NMR-Messungen eingesetzt. In diesen
Spektren waren fast alle Signale des Proteins zu erkennen und somit eine wichtige Voraussetzung für eine Strukturaufklärung gegeben. Das 15N-markierte Nef-Protein wurde auch unterstützend für die NMR-Strukturaufklärung der N-terminalen Anker-Domäne von Nef verwendet. Die NMR-Experimente zeigten, dass dieser Teil des Nef-Proteins ungefaltet und mit Ausnahme einiger kurzer helikaler Abschnitte gestreckt vorliegt. In dieser Dissertation wurden ferner drei neue Bindungspartner für Nef identifiziert: Aktin, Myosin und Calmodulin. Die experimentellen Daten zeigten, dass Nef eine mittelstarke Affinität von etwa 10 µM zu F-Aktin besitzt und mit steigender Konzentration die Polymerisation des Aktins verlangsamt. Für die Wechselwirkung mit Calmodulin wurden Werte im mikromolaren bis nanomolaren Bereich erhalten, was für eine starke Bindung spricht. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Calmodulin-Bindung calciumabhängig ist. Für Myosin ergaben sich erste Hinweise für eine Wechselwirkung mit Nef. Eine nähere Charakterisierung der Nef-Myosin Interaktion steht noch aus. Aus früheren Versuchen war bekannt, dass Nef spezifisch von der viralen Protease in zwei Domänen gespalten werden. Da Nef in eukariontischen Zellen myristoyliert vorliegt, wurde der Einfluss dieser Myristoylierung auf die proteolytische Spaltung von HIV-1 Nef durch die HIV-1 Protease untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Myristinsäure die proteolytische Spaltung nicht beeinflusst. Ferner zeigte sich, dass HIV-1 Nef auch von der HIV-2 Protease gespalten wird, wenn auch weniger spezifisch.

Translation of the abstract (English)

In this thesis structural and functional characteristics of the Nef protein were cleared up and potential interaction partners were identified. Both HIV-1 Nef and the N-terminal shortened HIV-1 Nef-core were successfully 15N-labelled in minimal media and isolated in mg-amount with a purity of >=95 The used minimal medium was optimized also for 15N/13C double-labelling. Purified isotope-labelled ...

Translation of the abstract (English)

In this thesis structural and functional characteristics of the Nef protein were cleared up and potential interaction partners were identified. Both HIV-1 Nef and the N-terminal shortened HIV-1 Nef-core were successfully 15N-labelled in minimal media and isolated in mg-amount with a purity of >=95 The used minimal medium was optimized also for 15N/13C double-labelling. Purified isotope-labelled Nef protein was used in 15N-NMR measurements. In these spectra almost all signals of the protein were visible thus given an important requirement for structure determination. The 15N-labeled Nef protein was also used for the NMR structure determination of the N-terminal anchor domain of Nef. The NMR experiments of the myristoylated anchor showed that this part of the Nef protein is unfolded and stretched except of some short helical segments. In this thesis three new binding partners for Nef were identified: Actin, myosin and calmodulin. The experimental data showed that Nef has a medium binding affinity of approximately 10 µM to F-actin and decreases the polymerization rate of actin with increasing Nef concentration. For the interaction with calmodulin a binding constant in the micro-molecular to nano-molecular range were obtained, which represents a strong binding of the two proteins.
It was shown further that calmodulin interaction is calcium dependent. For Myosin first results showed an interaction with Nef. A closer characterisation of the Nef-Myosin interaction still pends. From earlier experiments it was known that Nef is specifically cleaved by the viral protease in two domains. Since Nef is myristoylated in eukaryotic cells, the influence of this myristoylation was examined on proteolytic cleavage of HIV-1 Nef by the HIV-1 protease. The results of this study showed that myristine-acid does not influence proteolytic cleavage. Furthermore it showed up that HIV-1 Nef is cleaved also by the HIV-2 protease, although fewer specifically.

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