Funktionelle Untersuchungen zur Rolle des "transframe"- Proteins p6* bei der Replikation von HIV-1: Bedeutung der Proteasespaltstellen von p6* für die virale Maturation und Infektiosität

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	8 October 2003
Referee:	Ralf (Prof. Dr.) Wagner
Date of exam:	4 September 2003
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Biology, Preclinical Medicine
Keywords:	HIV , Proteasen , Prozessierung , Retroviren , Assembly , p6pol , p6* , Proteaseinhibition , Propeptid , Proteasespaltstellen , p6pol , p6* , cleavage sites , propeptide , protease inhibition
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	10124

Abstract (German)

Für die Entstehung reifer HIV-1 Partikel ist die Prozessierung der viralen Vorläuferproteine durch die viruseigene Aspartat-Protease (PR) absolut essentiell. Diese wird in Folge eines Leserastersprungs als Bestandteil des Gag-Pol-Polyproteins synthetisiert und durch schrittweise Autoprozessierung aus dem Vorläufer freigesetzt. In den letzten Jahren häuften sich Hinweise auf eine Beteiligung des ...

Abstract (German)

Für die Entstehung reifer HIV-1 Partikel ist die Prozessierung der viralen Vorläuferproteine durch die viruseigene Aspartat-Protease (PR) absolut essentiell. Diese wird in Folge eines Leserastersprungs als Bestandteil des Gag-Pol-Polyproteins synthetisiert und durch schrittweise Autoprozessierung aus dem Vorläufer freigesetzt. In den letzten Jahren häuften sich Hinweise auf eine Beteiligung des 68 Aminosäuren umfassenden N-terminal lokalisierten p6*-Propeptids an der Regulation dieser PR-Aktivierung. Dabei erwies sich rekombinantes p6* in vitro als kompetitiver PR-Inhibitor. Da p6* selbst ein Substrat der PR ist, sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, welche Rolle eine korrekte Prozessierung von p6* für die virale Maturation und Infektiosität spielt. Hierfür wurden rekombinante Proviren mit distinkten Modifikationen der N-terminalen, internen und C-terminalen PR-Spaltstellen von p6* hergestellt und deren Einfluss auf die virale Replikation in verschiedenen Zellkulturen analysiert. Dabei zeigte sich, dass (i) Modifikationen der N-terminalen Spaltstelle von p6* im viralen Kontext nicht möglich sind, ohne den überlappenden Gag-Leserahmen oder den Leserastersprung zu beeinflussen. (ii) eine Blockierung der internen PR-Spaltstelle von p6* keine Auswirkung auf die Autoprozessierung der PR oder die Virusreifung hat, was auf die Nutzung alternativer Spaltstellen hindeutet. (iii) eine vollständige Blockierung der C-terminalen Spaltstelle zur Freisetzung unreifer, nicht-infektiöser Viren führt, während eine Verzögerung dieser Spaltung die virale Reifung und Infektiosität nicht beeinflusst. Da sich eine Untersuchung der p6*-vermittelten PR-Inhibition im viralen Kontext als schwierig erwies, wurde zudem auf der Basis synthetischer HI-viraler Gene ein reduktionistisches Zellkultursystem etabliert, mit dessem Hilfe im Hinblick auf gentherapeutische Anwendungen der inhibitorische Einfluss von verschiedenen p6*-Proteinen auf die PR-Aktivität hinterfragt werden kann.

Translation of the abstract (English)

The generation of mature HIV-1 virions strongly depends on processing of the viral precursor proteins by the virus-encoded aspartic protease (PR). The PR is synthesized as a component of the Gag-Pol polyprotein due to a ribosomal frameshift and is released from the precursor by step wise autoprocessing. During the last years several lines of evidence indicated a role for the N-terminally adjacent ...

Translation of the abstract (English)

The generation of mature HIV-1 virions strongly depends on processing of the viral precursor proteins by the virus-encoded aspartic protease (PR). The PR is synthesized as a component of the Gag-Pol polyprotein due to a ribosomal frameshift and is released from the precursor by step wise autoprocessing. During the last years several lines of evidence indicated a role for the N-terminally adjacent p6* propeptide in regulation of PR activation. Besides, recombinant p6* protein proved to be a competitive PR inhibitor in vitro. As p6* itself is a substrate for the PR, this study should help to clarify the importance of correct p6* cleavage for viral maturation and infectivity. For this purpose, recombinant proviruses carrying distinct amino acid substitutions within the N-terminal, internal and C-terminal PR cleavage sites of p6* were generated to examine effects of altered cleavage kinetics upon viral replication. Comparative analysis of the proviral mutants in different cell culture systems revealed, that (i) modifying the N-terminal cleavage site of p6* is not possible in the viral context without affecting the overlapping Gag reading frame or ribosomal frameshifting, (ii) blockage of the internal cleavage site of p6* does not influence autoprocessing of the PR or viral maturation indicating the presence of alternative cleavage sites, (iii) blocking the C-terminal cleavage site leads to release of immature non-infectious viruses, whereas delayed hydrolysis of this site does not seem to affect viral maturation or infectivity. As characterization of a proposed p6*-mediated inhibition of the PR turned out to be difficult in the viral context, a simple cell culture system based upon the expression of synthetic HIV genes was established, which should allow to study the inhibitory effects of diverse p6* variants on PR activity with regard to gene therapy applications.

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