Phot-Proteine steuern in ihrer Funktion als sensorische Blaulichtrezeptoren die Anpassung von Organismen an die Lichtverhältnisse in der Umgebung. In dieser Arbeit wurde der Photozyklus der lichtempfindlichen LOV1-Domäne aus dem Phot-Protein der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii mit Hilfe der transienten Absorptionsspektroskopie untersucht.
Die LOV1-Domäne enthält ein Flavin-Mononucleotid als Chromophor. Bei Belichtung geht der Chromophor zunächst in den angeregten Triplettzustand über, der mit zwei Zeitkonstanten von 800 Nanosekunden und 4 Mikrosekunden abklingt. Diese lassen sich einer effizienten Reaktion in das Photoprodukt zuordnen, das sich bei der Reaktion des Triplettzustands mit dem benachbarten Cystein 57 bildet. Das Absorptionsspektrum des Photoprodukts zeigt einen für Flavin-C(4a)-Thiol-Addukte charakteristischen Verlauf mit einem Maximum bei 390 nm. Das Addukt ist nur metastabil und reagiert mit einer Zeitkonstante von 200 s wieder in den Dunkelzustand zurück. Die Kinetik der Rückreaktion hängt stark von den Umgebungsbedingungen wie pH-Wert und Salzkonzentration der Lösung ab. Es wurden deutliche Hinweise darauf gefunden, dass die Rückreaktion auch photochemisch induziert abläuft.
Um den Mechanismus der Adduktbildung aufzuklären, wurde in einer Mutante das reaktive Cystein durch ein Methionin ausgetauscht. In der Photoreaktion der C57M-Mutante bildet sich aus einer Reaktion der terminalen Methylgruppe des Methionins mit dem Flavin ein N(5)-Addukt. Dieses Addukt wird in einer thermischen Folgereaktion zu einem Neutralradikal des Flavins oxidiert. Das Produkt enthält eine kovalente Bindung zwischen Chromophor und Apoprotein und ist daher selbst unter aeroben und denaturierenden Bedingungen stabil. Damit unterscheidet es sich deutlich von anderen Flavoproteinradikalen. In der C57M-Mutante kann ein ionischer Mechanismus der Adduktbildung über eine Deprotonierung des Methionins und eine Protonierung des FMN-Triplettzustands weitgehend ausgeschlossen werden. Weitaus plausibler ist hier ein radikalischer Mechanismus, der auch auf die Reaktion des Wildtyps übertragen werden kann.

Phot proteins comprise a family of sensory blue light photoreceptors. They regulate the response of organisms to the light conditions in the environment. The photocycle of the light-sensitive LOV1 domain of the Phot protein from the green alga Chlamydomonas reinhardtii was investigated by time-resolved absorption spectroscopy.
The LOV1 domain noncovalently binds flavin mononucleotide as a chromophore. Upon absorption of blue light, the triplet excited state of the chromophore is formed and decays with two time constants of 800 nanoseconds and 4 microseconds. The decay is attributed to an efficient photoreaction of the flavin triplet state with the adjacent cysteine 57. The absorption spectrum of the product shows the characteristic maximum at 390 nm of a flavin C(4a)-thiol adduct. The adduct is metastable and reverts to the dark form with a time constant of 200 s. The back reaction kinetics depends on pH value and salt concentration of the medium. Evidence is presented that the back reaction can also be induced by light.
In order to clarify the mechanism of adduct formation, the reactive cysteine in the LOV1 domain was replaced by a methionine. In the photoreaction of the mutant C57M, an N(5) adduct is formed by the reaction of flavin with the terminal methyl group of methionine. In a secondary, thermal reaction the adduct is oxidized to a neutral flavin radical. The product contains a covalent bond between chromophore and apoprotein and is stable under aerobic and denaturing conditions. This distinguishes the reaction product from other flavoprotein radicals. In the mutant, an ionic mechanism of adduct formation via deprotonation of the methionine and protonation of the flavin triplet state can be excluded. More likely, a radical mechanism takes place, that may also be present in the wild-type system.