| License: Publishing license for publications excluding print on demand (13MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-2953
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10192
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 12 April 2004 |
| Referee: | Achim (Prof. Dr.) Göpferich |
| Date of exam: | 28 July 2003 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Technology (Prof. Göpferich) |
| Keywords: | Tissue Engineering , Fettzelle , Fettsucht , Blockpolymere , Plastische Chirurgie , Biomaterial , Kraftmikroskopie , Laminin , Polymerase-Kettenreaktion , In vivo , In vitro , Zellkultur , Zelldifferenzierung , Bioreaktor , Grundlagenforschung , 3T3-L1 , adipose tissue engineering , adipogenesis , fat , scaffold , biomaterial |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10192 |
Abstract (English)
Engineered adipose tissue equivalents are increasingly acknowledged to serve for both fat grafting and basic research of obesity. As the current approaches do not allow for the formation of the desired coherent constructs, this thesis focused on the establishment of a fat-like model system capable of overcoming the present limitations. The 3-D model system was composed of the preadipocyte cell ...
Abstract (English)
Engineered adipose tissue equivalents are increasingly acknowledged to serve for both fat grafting and basic research of obesity. As the current approaches do not allow for the formation of the desired coherent constructs, this thesis focused on the establishment of a fat-like model system capable of overcoming the present limitations.
The 3-D model system was composed of the preadipocyte cell line 3T3-L1 and commercially available polyglycolic acid (PGA) fiber meshes as polymeric cell carrier. To assess appropriate tissue-inducing substances, different cell culture media and hormonal induction protocols (including the PPARgamma agonists indomethacin and troglitazone) were evaluated. The results of the study indicated that adipose conversion of 3T3-L1 cells was substantially improved in alpha-MEM as compared to DMEM. Furthermore, hormonal induction with corticosterone, IBMX, insulin, and indomethacin resulted in appropriate differentiation properties suitable for the TE of fat.
In order to assemble fat-like constructs, distinct static and dynamic cultivation conditions were evaluated. In detail, PGA fiber meshes were dynamically seeded with 3T3-L1 preadipocytes; subsequently, cell-polymer constructs were hormonally induced and cultivation was performed either statically or dynamically in well-plates or in stirred bioreactors. Thereby, it could be shown that static cultivation in well plates is inferior to dynamic conditions with regard to the generation of adipose tissue. As the bioreactor approach did not feature any advantages over dynamic cultivation in well plates but entailed enhanced experimental requirements, it was considered to be less suitable to be routinely applied.
The established cultivation conditions were employed for the generation of fat-like constructs, which were characterized extensively. After short-term culture over 9 days, the engineered constructs featured tissue-like coherence and exhibited typical characteristics of adipocytes. However, die-punching showed that they were composed of well-differentiated cells in outer areas and less differentiated ones in internal parts. Furthermore, as compared to native fat, the adipocytes had not yet adopted the typical signet-ring form of unilocular cells. Therefore, the constructs were differentiated for prolonged periods of time (up to 35 days). Analysis of the resulting tissues elucidated completion of reorganization to structures histologically comparable to those of native adipose tissue. The microscopic observations were supported by investigations on the cellular and the molecular level. Afterwards, the engineered constructs were examined under physiological conditions in vivo. Not only were differentiated constructs s.c. implanted into nude mice but also PGA meshes seeded with undifferentiated 3T3-L1 preadipocytes. Subsequent to their excision, it could be shown that 3T3-L1 cells, when transplanted in the form of differentiated TE constructs, yielded vascularized fat pads histologically comparable to native fat. In contrast, blank control meshes and preadipocyte-seeded scaffolds did not result in adipose tissue formation in vivo.
Finally, Me.PEG-PLAs diblock copolymers, recently developed for controlled cell-biomaterial interactions, were investigated with regard to their usefulness for adipose tissue engineering. The biomaterials were processed into both 2-D polymer films and 3-D scaffolds, which were sterilized by UV irradiation prior to contact with the cells. In order to ensure unchanged polymer properties, an appropriate duration of exposure to UV light had to be assessed. For this purpose, films were subjected to UV irradiation for different periods of time and subsequently polymer properties were examined. The results indicated that UV treatment for 2 hours is an appropriate technique for sterilization of the Me.PEG-PLAs. However, UV irradiation for extended periods of time (5 and more hours) drastically altered the properties of the polymer films. Hence, adipogenesis on Me.PEG-PLAs was studied on cell carriers, which were previously sterilized by exposure to UV light for 2 hours. Me.PEG2-PLA20 polymers were demonstrated to allow for adipogenesis of 3T3-L1 cells. Nevertheless, the data from this study did not reveal an advantage over PGA or PLGA polymers with respect to adipose tissue development.
In summary, this thesis for the first time demonstrated the development of a coherent fat-like tissue in vitro. Furthermore, it could be shown, that s.c. implantation of these constructs into nude mice allows for development of vascularized fat pads in vivo. Hence, TE was proven useful to establish a valuable tool for investigation of adipogenesis within a tissue-like environment in vitro and in vivo. Application of the model is suggested to elucidate tissue inherent interactions and, thus, to contribute to a better understanding of adipose tissue physiology and development of obesity.
Translation of the abstract (German)
In der plastischen Chirurgie und der Grundlagenforschung gewinnt das Tissue Engineering (TE) von Fettgewebe zunehmend an Bedeutung. Da die bisherigen Ansätzen nicht zur Entwicklung eines zusammenhängenden Gewebes führten, war es das Ziel dieser Dissertation die derzeitigen Einschränkungen zu bewältigen und ein fettähnliches Modell-System zu etablieren. Das 3D Modell wurde aus Präadipozyten der ...
Translation of the abstract (German)
In der plastischen Chirurgie und der Grundlagenforschung gewinnt das Tissue Engineering (TE) von Fettgewebe zunehmend an Bedeutung. Da die bisherigen Ansätzen nicht zur Entwicklung eines zusammenhängenden Gewebes führten, war es das Ziel dieser Dissertation die derzeitigen Einschränkungen zu bewältigen und ein fettähnliches Modell-System zu etablieren.
Das 3D Modell wurde aus Präadipozyten der 3T3-L1 Zelllinie und kommerziell erhältlichen Polyglycolsäure (PGA) Gerüsten entwickelt, die als polymere Zellträger dienten. Um geeignete gewebeinduzierende Faktoren zu ermitteln, wurden verschiedene Zellkulturmedien und hormonelle Induktionsprotokolle (einschließlich der PPARgamma-Agonisten Indomethacin und Troglitazon) untersucht. Die Ergebnisse bewiesen, daß 3T3-L1 Präadipozyten in alpha-MEM besser verfetteten als in DMEM. Außerdem wurde gezeigt, daß die hormonelle Induktion mit Corticosteron, IBMX, Insulin und Indomethacin in günstigen Differenzierungseigenschaften für das Fettgewebs-TE resultierte.
Für die Entwicklung der Gewebe wurden ferner verschiedene statische und dynamische Kultivierungsbedingungen getestet. Zunächst erfolgte eine dynamische Besiedelung der PGA Gerüste mit 3T3-L1. Anschließend wurden die Zell-Polymer Konstrukte hormonell induziert und entweder statisch oder dynamisch (in Zellkulturschalen oder in gerührten Bioreaktoren) weiter kultiviert. Hierbei konnte gezeigt werden, daß dynamische Kulturbedingungen geeigneter für die Bildung von Fettgewebe sind als statische Verhältnisse. Die Eigenschaften der im Bioreaktor entwickelten Gewebe waren vergleichbar mit denen aus den Kulturschalen. Der erhöhte experimentelle Aufwand dieses Ansatzes schloß jedoch einen routinemäßigen Einsatz von Bioreaktoren aus.
Mit den etablierten Kulturbedingungen wurden fettartige Gewebe entwickelt, die anschließend ausführlich charakterisiert wurden. Nach 9 Tagen Kultivierung war der Zusammenhalt der Konstrukte gewebeähnlich und es konnten typische Fettzell-Eigenschaften nachgewiesen werden. Das Stanzen der Konstrukte zeigte, daß die Außenbereiche aus Fettzellen bestanden, wogegen die Innenbereiche nur schlecht differenziert waren. Die typische Siegelringform von univakuolären Adipozyten, wie sie in nativem Fett zu finden sind, war ebenfalls noch nicht zu detektieren. Daher wurden die Gewebe über einen längeren Zeitraum (bis zu 35 Tage) differenziert. Die Analyse dieser Konstrukte zeigte, daß sich die Zellen zu histologischen Strukturen reorganisiert haben, die vergleichbar mit denen von natürlichem Fettgewebe sind. Untersuchungen auf zellulärer und molekularer Ebene bestätigten die mikroskopischen Beobachtungen. Anschließend wurden die Gewebe unter physiologischen Bedingungen in vivo untersucht. Dafür wurden differenzierte Konstrukte und PGA Gerüste besiedelt mit undifferenzierten 3T3-L1 Präadipozyten s.c. in Nacktmäuse implantiert. Nach der Entnahme konnte gezeigt werden, daß 3T3-L1 Zellen nur dann vaskularisierte Fettpolster ausbilden, wenn sie in Form von differenzierten TE-Konstrukten transplantiert wurden. Im Gegensatz dazu entwickelten unbesiedelte Kontrollgerüste und mit Präadipozyten besiedelte Gerüste in vivo kein Fettgewebe.
Schließlich wurde untersucht, ob Me.PEG-PLA Diblockcopolymere, die zur Kontrolle von Zell-Biomaterial Interaktionen entwickelt wurden, geeignete Materialien für das Fettgewebs-TE darstellen. Die Polymere wurden hierfür zu 2D Polymerfilmen und 3D Gerüsten verarbeitet, die vor dem Zell-Kontakt mit UV-Licht sterilisiert wurden. Um unveränderte Polymereigenschaften zu gewährleisten, mußte eine geeignete Dauer der UV-Bestrahlung ermittelt werden. Zu diesem Zweck wurden Filme unterschiedlich lang mit UV-Licht bestrahlt und anschließend die Polymereigenschaften überprüft. Die Ergebnisse bestätigten, daß die 2-stündige UV-Behandlung eine geeignete Methode zur Sterilisierung von Me.PEG-PLAs darstellt. Nach längerer Bestrahlung (5h und mehr) konnten jedoch drastische Änderungen der Polymerfilm-Eigenschaften verzeichnet werden. Folglich wurde die Adipogenese auf Me.PEG-PLA Zellträgern untersucht, die zuvor nur 2h sterilisiert wurden. Hierbei zeigte sich, daß 3T3-L1 Zellen auf Me.PEG2-PLA20 differenzieren; bezüglich der Fettgewebs-Entwicklung konnte allerdings kein Vorteil gegenüber PGA und PLGA festgestellt werden.
Zusammengefaßt wurde mit dieser Dissertation zum ersten Mal demonstriert, daß es möglich ist in vitro ein zusammenhängendes fettähnliches Gewebe zu generieren. Eine s.c. Implantation der Konstrukte in Nacktmäuse zeigte außerdem, daß diese sich in vivo zu vaskularisierten Fettpolstern entwickeln. TE ermöglichte somit die Etablierung eines Modell-Systems, mit Hilfe dessen Adipogenese in einem gewebeartigen Kontext sowohl in vitro als auch in vivo untersucht werden kann. Das Modell kann künftig der Aufklärung von gewebetypischen Interaktionen dienen und somit zu einem besseren Verständnis der Fettgewebs-Physiologie und der Ursachen von Adipositas beitragen.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 13:34
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