Die N-Glykosylierung von Asparaginresten naszierender Polypeptidketten im Lumen des ER ist eine der verbreitetsten essentiellen Proteinmodifikationen unter den Eukaryonten und ist von der Bäckerhefe S. cerevisiae bis zum Menschen hoch konserviert.
Hierbei wird ein auf dem Trägerlipid DolP schrittweise aufgebautes GlcNAc2Man9Glc3-Oligosaccharid auf Asparagin-Reste des Sequons Asn-Xaa-Ser/Thr durch einen heterooligomeren Enzymkomplex, der N-Oligosaccharyltransferase (OST) übertragen. Defekte in der N-Glykosylierung führen beim Menschen zu einer als CDG (Congenital Disorder of Glycosylation) bezeichneten Erkrankung.
In der vorliegenden Arbeit konnte für S. cerevisiae erstmals die Existenz zweier distinkter OST-Komplexe, eines OST3-Komplexes und eines OST6-Komplexes mit besonderer Bedeutung des Letzteren für die Zellwandstabilität, gezeigt werden.
Ein Solubilisierungsverfahren für die GlcNAc-Transferase aus Hefe (UDP-GlcNAc + DolPP-GlcNAc1 à DolPP-GlcNAc2 + UDP) wurde entwickelt, das aufgrund seiner hohen Aktivität und Stabilität die Charakterisierung des Enzyms erlaubte.
Weiter gelang die Entwicklung von in vitro-Verfahren zur präparativen Synthese definierter kurzkettiger Lipidoligosaccharide aus Enzymsolubilisaten. Diese Akzeptorsubstrate waren die Basis für den Aufbau spezifischer in vitro-Testverfahren für die sieben initialen Glykosyltransferasen aus humanen Fibroblasten, ausgehend von DolP bis DolPP-GlcNAc2Man5.
Erstmals konnte mit CDG-Ii ein Subtyp charakterisiert werden, der auf einen Defekt in einer der frühen Glykosylierungsreaktionen der LLO-Synthese, ablaufend auf der cytoplasmatischen Seite der ER-Membran, zurückzuführen ist. Dabei konnte einerseits gezeigt werden, daß es sich um einen Defekt im humanen Ortholog zum ALG2-Gen der Hefe handelt, zum anderen, daß das abgeleitete Genprodukt die alpha1,3-Manosyltransferase darstellt, welche nach der Übertragung des beta1,4- aber vor dem Transfer des alpha1,6-Mannosylrests in der LLO-Synthese agiert.
Ein weiterer CDG Subtyp (CDG Ig) wurde enzymatisch als Defekt im humanen Ortholog zum Hefe ALG12 charakterisiert. Alg12 katalysiert in einer DolP-Man abhängigen Reaktion luminal den Schritt von LLO-Man7 nach LLO-Man8.

Protein N-glycosylation in the ER lumen is one of the most common essential eukaryotic protein modifications and highly conserved from yeast to man.
In this process, a stepwise preassembled core-oligosaccharide, GlcNAc2Man9Glc3, bound to the lipid carrier dolichol is transferred to Asn residues of the sequence Asn-Xaa-Ser/Thr by a heterooligomeric enzyme complex, the N-Oligosaccharyltransferase (OST). Defects in reactions constituting N-glycosylation lead to a disease known as CDG (Congenital Disorder of Glycosylation).
In this work was shown for the first time for S. cerevisiae the existence of two distinct OST-complexes, designated as OST3- and OST6-complex. The latter is of special importance for yeast cell wall stability.
For the GlcNAc-transferase from yeast involved in lipid-linked oligosaccharide (LLO) synthesis (UDP-GlcNAc + DolPP-GlcNAc1 à DolPP-GlcNAc2 + UDP) a solubilization procedure was developed, which allowed the characterization of the enzyme on account of its high activity and stability.
Furthermore in vitro systems were accomplished for the preparative synthesis of short chain LLOs from solubilized enzyme extracts. These acceptor substrates were the basis for the development of corresponding in vitro tests in human fibroblasts for seven glycosyltransferases comprising the reactions from DolP to DolPPGlcNAc2Man5.
A new CDG subtype, CDG Ii, has been characterized which could be put down to a defect in one of the early cytoplasmically oriented glycosylation reactions of LLO-synthesis. On one hand the human ortholog of yeast ALG2 was shown to be affected, on the other hand the corresponding gene product was defined to be the alpha1,3-mannosyltransferase acting subsequent to the transfer of the beta1,4- but before the transfer of the alpha1,6-linked mannose.
Moreover, another CDG subtype (CDG Ig) was characterized enzymatically as a defect in the human ortholog of yeast ALG12. The corresponding enzyme catalyzes the DolP-Man dependent ER-luminal reaction from LLO-Man7 to LLO-Man8.