Im Rahmen dieser Arbeit wurden die molekulare Anordnung und die laterale
Verteilung von Annexin A2t und A2m auf Membranoberflächen visualisiert und
charakterisiert. An Hand topographischer Untersuchungen konnte gezeigt werden,
dass Annexin A2t mit beiden Annexin - Molkülen des Proteinkomplexes an
die Membran gebunden ist. Hierzu wurden mittels LB- Übertrag Lipiddoppelschichten aus 1,2 - Dipalmitoyl - sn - glycero - 3 - phosphocholin (DPPC) und 1,2 - Dipalmitoyl - sn - glycero - 3 - phosphoserin (DPPS) hergestellt, an die das Annexin adsorbiert wurde. Die in der Topographie sichtbaren runden Domänen sind auf die spezifische Bindung des Annexins an DPPS-haltige Bereiche der Lipidschicht zurückzuführen und weisen einen Höhenunterschied von 4.2nm zur Membranoberfläche auf. Ein Vergleich der Höhe von membrangebundenem Annexin A2m und A2t zeigt, dass beide Annexin - Monomere des Annexin A2t -Komplexes an die Membran gebunden sind.
Desweiteren wurde die Reversibilität der Ca2+- abhängigen Annexin A2m-
Membranbindung mit der Quarzmikrowaagetechnik untersucht. Der Adsorptions-
und Desorptionsprozeß zeigt zwei Wendepunkte bei steigender Ca2+- Ionenkonzentration, die auf die Assoziation des Proteins mit unterschiedlich affinen Bindungsstellen zurückzuführen sind. Im nanomolaren Bereich erfolgt ein kooperativer Bindungsprozeß an hoch affine Bindungsstellen, während die im mikromolaren Bereich beobachtete Interaktion mit niedrig affinen Bindungsplätzen nicht-kooperativ erfolgt. Ausgehend von einem von Ross entwickelten Modell für die reversible Annexin A2t -Membranbindung konnte aus der lediglich gering ausgeprägten Hysterese zwischen Adsorptions- und Desorptionskurve des Annexin A2m geschlossen werden, daß Annexin A2m im Gegensatz zu Annexin A2t nur geringfügig Membran - organisierende Eigenschaften besitzt.
Mit Hilfe der Fluoreszenz- und Rasterkraftmikroskopie konnte die laterale
Verteilung sowohl des Annexin A2m als auch des Annexin A2t auf Lipiddoppelschichten aus 1 -Palmitoyl - 2 - Oleoyl - sn - glycero - 3 - phosphocholin (POPC) und 1 -Palmitoyl - 2 - Oleoyl - sn - glycero - 3 - phosphoserin (POPS) visualisiert werden. In den mikroskopischen Aufnahmen sind laterale Proteinaggregate unterschiedlicher Größe und Form zu erkennen, die im Fall des Monomers 8% und im Fall des Heterotetramer 11% der Oberfläche bedecken. Die Gößenverteilung der lateralen Aggregate des Annexin A2m und A2t zeigt, dass monomeres Annexin tendenziell kleinere Domänen ausbildet als Annexin A2t. Für beide Proteine ist der Höhenunterschied zur Lipidoberfläche der POPC/POPS-Membran um etwa 2.5nm niedriger als auf den festeren DPPC/DPPS- Schichten, wodurch eine teilweise Insertion der Annexin - Moleküle in die fluide Lipidmembran nachgewiesen werden konnte. Zudem konnte gezeigt werden, dass Cholesterin die Festigkeit der POPC/POPS-Membran erhöht, worauf die Insertion des Annexins in die Lipidschicht behindert wird.
Desweiteren wurde die Wechselwirkung des Proteinliganden p11 mit membrangebundenem Annexin A2m untersucht. Aus topographischen Aufnahmen ist
ersichtlich, dass p11 nicht oder nur geringfügig mit Annexin A2m interagiert, wenn dieses bereits an eine Membran gebunden ist. Dies stellt einen wichtigen Hinweis auf die regulatorische Funktion des p11 auf die Annexin -Membranrekrutierung dar.
In rasterkraftmikroskopischen Aufnahmen der Annexin A2t - Aggregate auf
POPC/POPS- Schichten konnte eine Verarmung an PS - reichen Lipiddomänen
nachgewiesen werden. Eine durch Annexin A2t - induzierte laterale Organisation
negativ - geladener PS - Lipide wurde erstmals im Rahmen dieser Arbeit visualisiert.

Annexins are a family of structurally related proteins that reversibly
bind to membranes containing anionic phospholipids in a calcium-dependent
manner. Annexin A2 is special among the family as it can exist in two different
physiological states, as annexin A2 monomer and as an heterotetrameric complex,
which consists of two annexin A2 molecules connected via their N-terminal region
by a p11 (S100A10) dimer. The heterotetramer, which is the predominant form
in cells, is bound to the plasma membrane and early endosomes, whereas monomeric
A2 is localized in the cytosol. Though the distinct function of annexin A2
is still unknown, its capability of aggregating chromafin granules and phospholipid vesicles was unambiguously shown indicating its role in endocytosis. The molecular organization of the junctions between membrane surfaces linked by the annexin A2t complex is still a matter of debate. Two different models have been proposed which differ in their molecular arrangements leading to two different height profiles of protein bound to a lipid membrane. The aim of this study was to investigate the molecular arrangement of the protein on the membrane surface.
By a detailed height analysis of topographical images of bound annexin A2 obtained by scanning force microscopy, one of the two models could be clearly favored.
Experiments have shown that the complex (A2p11)2 is capable of clustering detergent resistent membranes in the presence of Ca2+- ions, which have led to the hypothesis that annexin A2 is able to laterally organize membrane lipids. In this study Ca2+- titration experiments of annexin A2m-membrane binding performed by quarz crystal microbalance (QCM) indicated a significant difference in the lateral oragnization ability of monomeric compared to heterotetrameric annexin A2. By means of scanning force and fluorescence microscopy of artificial membrane systems immobilized on mica surfaces, the lateral organization of bound annexin A2 to lipid bilayers and its influence on the lateral organization of the lipids within the membrane induced by protein binding was visualized. The influence of cholesterol on the lateral annexin A2t surface distribution was described.
In this regard cholesterol was shown to retard the indentation of annexin molecules observed on fluid model membranes. Furthermore this investigation suggested the inability of the p11 ligand to interact with membrane bound annexin A2 indicating a regulatory role of p11 for annexin membrane recruitment.