Untersuchung von gentechnologisch mutierten Modifizierten Vacciniaviren Ankara als Beitrag zur Entwicklung neuartiger Virusimpfstoffe

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-opus-6516
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.10442

Zarniko, Kerstin

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Date of publication of this fulltext: 19 Jun 2006 07:47

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	18 June 2006
Referee:	Susanne (Prof. Dr.) Modrow
Date of exam:	24 October 2005
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Biology, Preclinical Medicine
Keywords:	Gedächtniszelle , Immunmodulation , Immunmodulator , Immunbiologie , Interleukin 18 , Interleukine , Glucocorticosteroide , Hydroxysteroide , Virusvektor , Virusimpfstoff , Vaccinia-Virus , Bindeproteine , Gentechnologie , Virusneutralisation , Modifiziertes Vacciniavirus Ankara (MVA) , virale Vektoren , IL-18 Bindungsprotein , IL-1b Rezeptor , 3b-Hydroxysteroiddehydrogenase , Modified Vacciniavirus Ankara (MVA) , poxviruses , immunomodulation , viral vectors , IL-18 binding protein
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	10442

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Abstract (German)

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Das Modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) wurde als hochattenuiertes und in seiner Vermehrungsfähigkeit stark eingeschränktes Vacciniavirus bereits erfolgreich bei der Pockenschutzimpfung eingesetzt. Heute gilt es zudem als vielversprechender Kandidat für die Entwicklung rekombinanter Virusimpfstoffe. Eines der Forschungsziele ist dabei, MVA durch weitere gentechnische Modifikation für den Einsatz als Impfvirus zu optimieren. Möglichkeiten dieses Ziel zu erreichen bestehen in der Eliminierung viraler Gensequenzen, die für Proteine mit potentiell immunmodulierenden Eigenschaften kodieren. Da mit der Deletion des viralen Interleukin 1b Rezeptors (vIL-1bR) bereits ein erfolgreicher Schritt in diese Richtung getan wurde, stellt die Deletion weiterer Gene und vor allem die Generierung von Mehrfachmutanten zur möglichen Potenzierung einzelner, kleiner Effekte ein spannendes Forschungsfeld dar. In dieser Arbeit wurde die Eliminierung von zwei viralen Genprodukten, das IL 18 Bindungsprotein (vIL 18BP) und das Enzym 3b Hydroxysteroid Dehydrogenase/D5 D4 Isomerase (v3b HSD) in MVA und der MVA-Deletionsmutante DIL-1bR vorgenommen. Die Konstruktion von zwei Einzel-, drei Zweifach- und einer Dreifachdeletionsmutante erfolgte über homologe Rekombination und Selektion der Viren in Zellkultur. Zur Charakterisierung der MVA-Mutanten wurden anschließend in vitro- und in vivo- Experimente durchgeführt.
Es konnte gezeigt werden, dass Veränderungen auf genetischer Ebene im Virus ausschließlich an den ausgewählten Genomorten stattgefunden haben und dass das Replikationsverhalten der Viren trotz Deletion von bis zu drei Genen unverändert erhalten geblieben ist. Desweiteren zeigten in vitro-Untersuchungen die Synthese eines funktionellen vIL 18BP nach MVA-Infektion und belegten die erfolgreiche Eliminierung des entsprechenden Gens im Genom der hergestellten Virusmutanten. Der in vitro-Charakterisierung der MVA-Mutanten folgten in vivo-Untersuchungen, die im Rahmen dieser Arbeit neben der Einzelmutante DIL 18BP auf die Mehrfachmutanten DIL 1bR DIL 18BP und DIL 1bR DIL 18BP D3b HSD beschränkt wurden. Nach intranasaler Applikation führten die Mehrfachdeletionsmutanten im Vergleich zu MVA zu überwiegend größeren Anteilen an Natürlichen Killerzellen in Lungen- und Peritonealspülungen der untersuchten Mäuse. Diese Ergebnisse bestätigten sich durch den Nachweis einer erhöhten Interferon g-Sekretion von Immunzellen geimpfter Tiere. In Untersuchungen zur Langzeitimmunität konnten ebenfalls höhere MVA spezifische Gedächtnis-T-Zellantworten mit der Zweifach- und Dreifachmutante als mit dem Wildtypvirus beobachtet werden. Zudem zeigten weitere Analysen zur Schutzwirkung nach Impfung noch während der frühen Phase der Immunantwort Vorteile für die Mehrfachmutanten.
Insgesamt lassen die erhaltenen Ergebnisse die Schlußfolgerung zu, dass die Deletion des vIL 1bR-, vIL 18BP- und v3b HSD-Gens zu einer höheren in vivo-Immunogenität im Vergleich zu MVA führt und zeigen damit, dass die Eliminierung auch weiterer potentieller Immunmodulatoren richtungsweisend sein könnte für die Generierung eines optimierten vacciniaviralen Vektorsystems.

Translation of the abstract (English)

Highly attenuated Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) has been used successfully for vaccination against poxvirus-caused-disease. Today it serves as candidate for development of recombinant vaccines against infectious diseases and cancer. One trial is to further optimize MVA for vaccination by genetic modification. An approach is the elimination of viral genes, which encode for proteins with potentially immune modulating features.
Deletion of the viral interleukin 1b-receptor (vIL-1bR) from the viral genome leads to improved MVA immunogenicity, so that the elimination of further genes is a promising field for investigation. Of special interest is the generation of double- or even triple-deletion mutants to accumulate the effect of the missing single genes.
This project focussed on the generation of deletion mutants by eliminating two viral gene products, the IL-18 bindingprotein (vIL-18BP) and the enzyme 3b Hydroxysteroide Dehydrogenase/D5 D4 Isomerase (v3b-HSD) in MVA and in the MVA-deletion mutant DIL-1bR. The construction of two single-, three double- and the triple-deletion mutant was achieved by homologous recombination and selection of the resulting viruses in cell culture. The subsequent characterization of the deletion mutants was performed in in vitro- and in vivo- assays. It could be shown that changes in the viral gene sequences had taken place exclusively in the selected gene loci and that even the deletion of up to three genes did not alter the replicative capacity of the viruses. Furthermore, expression of a functional vIL-18BP after infection with MVA and the lack of this gene in the deletion mutants could be shown.
Subsequently the single-deletion virus DIL 18BP and the mutant MVA viruses DIL 1bR DIL 18BP and DIL-1bR DIL-18BP D3b-HSD were characterized in vivo. In comparison to MVA intranasal or intraperitoneal vaccination with the deletion mutants led to enhanced levels of natural killer cells and increased IFNg-secretion in the lungs and peritoneum of immunized mice. In addition, enhanced levels of MVA-specific memory T cells could be detected in spleens of immunized mice after application of the double- and triple-deletion mutants. Furthermore, analysis of the protective capacity in mice in short term protection experiments indicated an advantage for the mutant viruses compared to MVA.
The resulting data suggest that deletion of the vIL-1bR-, vIL-18BP- and v3b-HSD-gene sequences lead to improved immunogenicity of MVA.
Further elimination of MVA genes with a potential for host immune modulation, could be an approach to generate rationally designed, optimized third generation MVA vaccines.

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