Das Kapsid des ältesten bekannten humanpathogenen Vertreters innerhalb der Parvoviridae, Parvovirus B19, besteht aus zwei Strukturproteinen VP1 und VP2. Das VP2-Protein stellt im viralen Partikel einen Anteil von 95 %. Es spielt eine wichtige Rolle bei der T-Zell-Antwort und VP2-spezifische konformationelle Epitope induzieren eine lang anhaltende Immunantwort. Rekombinant hergestellte VP2-Kapside im Baculovirus-Expressionssystem sind für viele Tests zum Nachweis von Parvovirus-B19-spezifischen Antikörpern ein wichtiges Antigen.
Ziel vorliegender Arbeit war es, ein alternatives Expressionssystem zu etablieren, das VP2- und VP1/VP2-Mischkapside in hoher Qualität und Ausbeute produzieren kann. Der Grund für die Etablierung eines alternativen Expressionssystems sind die hohen Kosten und die umständliche Handhabung die das Baculovirussystem auszeichnen. Die rekombinant produzierten Virus-ähnlichen Partikel sollten molekularbiologisch, histologisch sowie immunologisch charakterisiert und mit Kapsiden aus dem Baculovirus-Expressionssystem verglichen werden.
Als eukaryontische Expressionssysteme standen die Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, Drosophila-Schneider-2-Zellen sowie die trypanosomenartigen Leishmania-tarentolae-Zellen zur Verfügung. Einzig in der Bäckerhefe war es möglich, VP2-Kapside zu produzieren. Als nächstes wurde die Kapsidsynthese optimiert. Dabei wurden verschiedene Anzuchtsbedingungen, Nährmediumzusammensetzungen und Hefestämme getestet. Der Protease-defiziente Saccharomyces-Stamm HT393 produzierte im Vergleich zu dem kommerziell erhältlichen Stamm INVSc2 deutlich mehr VP2-Protein und zeigte weniger Proteindegradation. Desweiteren wurden Methoden zur Reinigung der rekombinanten VP2-Kapside entwickelt und anschließend optimiert.
Der Aufschluss der Bäckerhefe gelang über Hochdruck, der über 95 % der Zellen zerstörte. Die Aufreinigung der VP2-Kapside wurde über mehrere Ultrazentrifugationsschritte erreicht. Gewählt wurde eine Kombination aus Differential- und isopyknischer Zentrifugation. Diese beiden Ultrazentrifugationstechniken lieferten den besten Kompromiss aus Ausbeute und Reinheit.
Im Elektronenmikroskop konnten keine Unterschiede zwischen Partikeln aus der Bäckerhefe, Baculovirus infizierten Insektenzellen oder nativen Viren festgestellt werden. Ähnlich waren auch die Ergebnisse aus vergleichenden ELISA-Tests und dem T-Zell-Proliferationsassay. Demnach haben in Bäckerhefe produzierte VP2-Kapside dieselbe Antigenizität und Immunogenität wie Partikel aus dem Baculovirus-Expressionssystem.
Schließlich wurde überprüft, ob mittels eines dualen Vektorsystems beide Strukturproteine VP1 und VP2 in Saccharomyces cerevisiae produziert werden können. Die Ergebnisse zeigten eine Co-Synthese des VP1- und VP2-Proteins in selben Mengenverhältnissen. Zur Generierung von Mischkapsiden muß allerdings die Menge an VP1-Protein auf maximal 40 % der Gesamtmenge an Strukturprotein beschränkt werden.

The capsid of parvovirus B19 consists of the two structural proteins VP1 and VP2. The VP2-protein portion within the capsid is 95 %. It plays an important role regarding T-cell response and conformational epitopes induce a long lasting immune response. VP2-capsids recombinantly produced in the baculovirus expression system are an important antigen for several tests which detect parvovirus B19 specific antibodies.
The goal of this thesis work was to establish an alternative expression system which is able to produce VP2- and VP1/VP2-mixed particles of high purity and large quantity. The need for that are high costs and difficult handling which are characteristics of the baculovirus expression system. The recombinantly produced particles should be characterized on a molecular basis as well as histologically and immunologically. Furthermore these capsids should be compared with capsids derived from the baculovirus system.
Saccharomyces cerevisiae (bakers yeast), Drosophila Schneider-2-cells and Leishmania tarentolae cells were available as eukaryotic expression systems. Only bakers yeast was able to produce VP2-capsids. The next step was the optimization of the capsid synthesis. To do this, different culture conditions, growth media compositions and yeast strains were employed. The protease-deficient strain HT393 produced more VP2-protein and showed less protein degradation than the commercially available strain INVSc2. Furthermore methods to purify the recombinant VP2-capsids were established and optimized.
The disruption of yeast cells was accomplished by high pressure, which was bale to crack 95 % of the cells. The purification of the VP2-capsids was accomplished via successive ultracentrifugation steps. The method of choice was a combination of differential and isopycnic ultracentrifugation. This combination was the best compromise between high yield and purity.
Electron microscopy revealed no difference between particles produced in either bakers yeast, baculovirus infected insect cells or native virus. Similar results were also obtained in ELISA and T-cell proliferation assays. As a consequence of that, VP2-capsids from S. cerevisiae show the same antigenicity and immunogenicity when compared to those from the baculovirus expression system.
Finally, it was assessed if both structural proteins VP1 and VP2 could be produced in bakers yeast. The results demonstrate a co-synthesis of the VP1- and VP2-protein in same proportions. To generate mixed particles, the VP1-portion must not exceed 40 % of total structural protein.