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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-6695
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10504
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 July 2007 |
| Referee: | Michael (Prof. Dr.) Thomm |
| Date of exam: | 27 April 2006 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) > Prof. Dr. Michael Thomm |
| Keywords: | Transkription <Genetik> , Genregulation , Hitzeschocktranskriptionsfaktor , Hitzeschock-Proteine , Archaebakterien , Pyrococcus furiosus , Phr , transcription , archaea , Phr , heat shock |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10504 |
Abstract (German)
Wie alle Organismen weist auch das hyperthermophile Archaeon Pyrococcus furiosus bei einer Temperaturerhöhung, die über die optimale Wachstumstemperatur hinausgeht, eine Hitzeschockantwort auf. Im Gegensatz zu den bakteriellen und eukaryotischen Systemen ist über die Regulation der archaeellen Hitzeschockantwort bisher wenig bekannt. Die vorliegende Arbeit beschreibt den ersten archaeellen ...
Abstract (German)
Wie alle Organismen weist auch das hyperthermophile Archaeon Pyrococcus furiosus bei einer Temperaturerhöhung, die über die optimale Wachstumstemperatur hinausgeht, eine Hitzeschockantwort auf. Im Gegensatz zu den bakteriellen und eukaryotischen Systemen ist über die Regulation der archaeellen Hitzeschockantwort bisher wenig bekannt.
Die vorliegende Arbeit beschreibt den ersten archaeellen Hitzeschockregulator. Es handelt sich um das Protein Phr (Pyrococcus heat shock regulator), welches durch den ORF PF1790 kodiert wird. Dieses Protein ist in verschiedenen Euryarchaeota konserviert. Es existieren keine bakteriellen oder eukaryotischen Homologe.
Phr hemmt spezifisch die in vitro-Transkription der beiden im Pyrococcus furiosus-Genom direkt hintereinander liegenden Hitzeschockgene aaa+atpase und hsp20. Außerdem hemmt Phr als Autoregulator die Transkription seines eigenen Gens. Durch EMSAs und DNaseI-Footprint-Analysen konnte der Mechanismus der Transkriptionshemmung aufgeklärt werden. Phr bindet die Hitzeschockpromotoren direkt stromabwärts der Transkriptionsfaktoren TBP und TFB und überlagert dabei den Transkriptionsstartpunkt. Dadurch wird die Anlagerung der RNA-Polymerase blockiert und die Initiation der Transkription verhindert.
Im Bindebereich von Phr konnte in allen drei Hitzeschockpromotoren das Palindrom 5´- TTT - - T - - C - - - - - G - - A - - AAA - 3´ identifiziert werden, welches als Erkennungssequenz von Phr vorgeschlagen wird.
In vivo Studien zeigten, dass die Gene aaa+atpase und phr unter Hitzeschockbedingungen verstärkt transkribiert werden. Auch beim Übergang von der exponentiellen zur stationären Wachstumsphase wird vermehrt aaa+atpase und phr-mRNA gebildet, was dafür spricht, dass diese Hitzeschockproteine möglicherweise auch im Stress der stationären Wachstumsphase eine Rolle spielen könnten.
Um die Phr-Bindung in vivo zu untersuchen, wurden Protein-DNA-Komplexe kovalent miteinander vernetzt. Nach Scheren der DNA und einer anschließenden Immunpräzipitation mit spezifischen Antikörpern gegen Phr wurden die an Phr gebundenen Gene identifiziert (ChIP-Technik). Auf diese Weise wurde bestätigt, dass Phr auch in vivo - bei 95°C - die Promotorsequenzen der Hitzeschockgene aaa+atpase, hsp20 und phr bindet. Bei 107°C, also unter Hitzeschockbedingungen, ist die Phr-Bindung an die Promotoren dagegen nicht mehr nachweisbar. Das könnte bedeuten, dass der Regulator Phr als direkter Thermosensor wirkt, indem er unter normalen Wachstumsbedingungen durch Promotorbindung die Transkription der Hitzeschockgene unterbindet. Bei einer Temperaturerhöhung dagegen denaturiert das Regulatorprotein und die Transkription der Hitzeschockgene wird durch die Dissoziation des Repressors von der DNA ermöglicht.
In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Professor Ladenstein (Karolinska Institut, Schweden) wurde die Struktur von Phr mit einer Auflösung von 3 Å bestimmt. Hierzu wurde ein Selenomethioninderivat von Phr hergestellt, bei dem alle fünf in Phr vorhandenen Methioninreste durch Selenomethionin ersetzt wurden. Die Strukturaufklärung erfolgte mit der Methode der anomalen Dispersion bei verschiedenen Wellenlängen (MAD). Der N-terminale Teil von Phr besteht aus einem wHTH-DNA-Bindemotiv. Dem klassischen wHTH-Motiv, das aus drei Helices besteht, ist eine vierte Helix N-terminal vorgelagert. Im zentralen Teil des Phr-Dimers bilden sich ein antiparalleles Zwei-Helix-Bündel und ein heterogenes beta-Faltblatt aus. Der C-terminale Bereich wird dominiert durch eine lange, stark negativ geladene alpha-Helix. Phr stellt damit vermutlich einen neuen Typ dimerer Transkriptionsfaktoren dar. Auch der Modus der DNA-Interaktion unterscheidet sich von denen bisher beschriebener wHTH-Proteine. Während die schon charakterisierten wHTH-Proteine die DNA entweder mit der Erkennungshelix 3 oder dem Flügel der DNA-Bindedomäne binden, sind bei Phr Aminosäuren in drei Helices sowie dem Flügel an der DNA-Bindung beteiligt.
Um die Phr-DNA-Bindung auf molekularer Ebene genauer zu untersuchen, wurde eine am C-Terminus um 106 Aminosäuren verkürzte Form von Phr hergestellt. Dieses hauptsächlich aus dem DNA-Bindemotiv bestehende Protein wurde zusammen mit Oligonukleotiden mit der Phr-Erkennungssequenz von Dr. Wei Liu aus der Arbeitsgruppe von Prof. Ladenstein in Cokristallisationsversuche eingesetzt. Kristalle dieser Protein-DNA-Komplexe liegen bereits vor, die Strukturberechnungen sind aber noch nicht abgeschlossen.
Durch die Aufarbeitung der durch die ChIP-Methode gewonnenen Präzipitate für Microarray-Analysen wurde der Weg bereitet, alle Phr-Bindestellen im Pyrococcus-Genom zu ermitteln. Die Microarray-Analysen werden in Kooperation mit dem Labor von Professor Michael Adams (Georgia, USA) durchgeführt.
Translation of the abstract (English)
Like all organisms the hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus shows a heat shock response when temperature increases above the optimal growth temperature. In contrast to bacterial and eukaryotic systems little is known about regulation of the archaeal heat shock response. The present work describes the first archaeal heat shock regulator. It is the protein Phr (Pyrococcus heat shock ...
Translation of the abstract (English)
Like all organisms the hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus shows a heat shock response when temperature increases above the optimal growth temperature. In contrast to bacterial and eukaryotic systems little is known about regulation of the archaeal heat shock response.
The present work describes the first archaeal heat shock regulator. It is the protein Phr (Pyrococcus heat shock regulator), which is encoded by ORF PF1790. Phr is conserved among several Euryarchaeota. There are no bacterial or eukaryotic homologues.
Phr specifically inhibits in vitro transcription of the two heat shock genes hsp20 and aaa+atpase, which lie in a row in the Pyrococcus furiosus genome. Phr is also an autoregulator by inhibiting transcription of its own gene. EMSAs and DNaseI footprinting analyses revealed the mechanism of transcription inhibition by Phr. Phr binds to the heat shock promoter downstream of the transcription factors TBP and TFB and covers the transcription start site, blocking association of RNA polymerase and inhibiting transcription initiation.
The palindrome 5´- TTT - - T - - C - - - - - G - - A - - AAA - 3´ could be identified in the Phr binding region of the three heat shock promoters. This sequence is proposed to be the Phr recognition site.
In vivo studies showed increased transcription of aaa+atpase and phr under heat shock conditions. Transcription is also increased at stationary growth phase, indicating that Phr might also act as a general stress factor.
To get insights into Phr binding in vivo, protein-DNA complexes were crosslinked. After shearing DNA and immunoprecipitation with Anti-Phr the genes bound by Phr were identified (ChIP-technology). With this assay we showed, that Phr binds to the heat shock promoters of aaa+atpase, hsp20 and phr in vivo at 95°C. However there is no Phr binding detectable under heat shock conditions at 107°C. Phr might act as a direct thermosensor by binding to heat shock promoters under normal growth conditions and thereby inhibits transcription of these genes. Under heat shock conditions Phr denaturates, dissociates from the promoters and enables heat shock gene transcription.
The Phr structure was solved at a resolution of 3 Å in cooperation with Prof. Ladenstein´s lab (Karolinska Institute, Sweden). For this a selenomethionine derivative of Phr was synthesized, in which all five methionine residues of Phr were substituted by selenomethionine. The structure was solved using the multiwavelength anomalous dispersion (MAD) method. The N-terminal part of Phr contains a wHTH DNA binding motif. In this motif there is an additional fourth helix at the N-terminus of the classical wHTH motif, which consists of only three helices. In the central part of the Phr dimer there is an antiparallel two-helix bundle and a heterogenous beta-sheet. The C-terminal part is characterized by a long, negatively charged alpha-helix. Phr may represent a novel folding type among dimeric transcription factors. The mode of Phr-DNA interaction is also different from other winged helix proteins. Whereas the already characterized winged helix proteins bind DNA with the recognition helix 3 or the wing, Phr uses aminoacids in three helices and the wing for DNA binding.
To investigate Phr-DNA interaction at molecular level, a truncated version of Phr was constructed. This protein lacks 106 aminoacids at the C-terminus and is basically composed of the DNA binding motif. Dr. Wei Liu (group of Prof. Ladenstein, Sweden) crystallized the truncated Phr in the presence of oligonucleotides that contain the Phr recognition sequence. However the design of the Phr-DNA complex structure is not finished yet.
The ChIP-method is the first step for investigating all Phr binding sites in the Pyrococcus genome with microarrays. The microarray analyses will be made in cooperation with Prof. Michael Adams´ lab (Georgia, USA).
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:51
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