| License: Publishing license for publications excluding print on demand (16MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-7483
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10524
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 12 December 2007 |
| Referee: | Hans-Robert (Prof. Dr. Dr.) Kalbitzer |
| Date of exam: | 8 December 2006 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Keywords: | Kälteschock-Proteine , Heterologe Genexpression , Escherichia coli , Zellfreies System , zellfreie Proteinexpression , cellfree protein expression |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10524 |
Abstract (German)
Die zellfreie Proteinexpression hat sich im Laufe der Zeit von einer Methode der Grundlagenforschung, primär angewandt bei der Aufklärung des genetischen Codes, zu einer sinnvollen präparativ anwendbaren Methode entwickelt. Verantwortlich dafür war zum einen die Entwicklung hochaktiver Lysate vor allem aus E. coli oder Weizenkeimlingen, zum anderen aber auch die Anwendung effektiver ...
Abstract (German)
Die zellfreie Proteinexpression hat sich im Laufe der Zeit von einer Methode der Grundlagenforschung, primär angewandt bei der Aufklärung des genetischen Codes, zu einer sinnvollen präparativ anwendbaren Methode entwickelt. Verantwortlich dafür war zum einen die Entwicklung hochaktiver Lysate vor allem aus E. coli oder Weizenkeimlingen, zum anderen aber auch die Anwendung effektiver Transkriptionssysteme auf der Basis viraler Polymerasen und die Etablierung von effizienten Energieregenerationssystemen. Dadurch wurde es möglich, verschiedene Proteine in großen Mengen herzustellen. Jedoch besteht bei dieser Expressionsmethode das Problem, dass viele Proteine nur in einem unzureichenden Umfang exprimiert werden können. Gründe dafür sind unter anderem in der Unzugänglichkeit der frei vorliegenden mRNA und in der Wahl der verwendeten Codonen zu suchen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden deshalb Wege untersucht, um die Expressionsrate von ausgewählten Proteinen unter Verwendung von Lysaten aus E. coli zu erhöhen.
Es wurde dabei versucht, zum einen das Expressionssystem selbst zu verändern, und zum anderen das Protein an die Gegebenheiten des auf E. coli basierenden Systems anzupassen. Bei der Anpassung des Systems selbst wurde versucht, durch den Zusatz von Kälteschockproteinen, die als RNA-Chaperone angesehen werden, das Niveau an Sekundärstrukturen auf der mRNA zu reduzieren. Denn solche Haarnadelschleifen können dafür verantwortlich sein, dass regulatorische Sequenzen, zum Beispiel Promotoren, dem Translationssystem nicht zugänglich sind und deshalb die mRNA nicht abgelesen werden kann. Entgegen dieser weit verbreiteten Hypothese konnte durch die Titration von CSPs zu der Expression von CAT bzw. Ras keine Erhöhung der Expressionsrate, sondern eine Inhibierung der Reaktion festgestellt werden. Eingehendere Untersuchungen haben ergeben, dass sowohl Transkription als auch Translation von dieser Hemmung betroffen sind und der beschriebene Effekt auf der Nukleotidbindung der CSPs beruht. Daraus konnte der Schluss gezogen werden, dass Kälteschockproteine keine verallgemeinerbare RNA-Chaperonaktivität besitzen, wie in der Literatur beschrieben ist.
Desweiteren wurde untersucht, ob eine Anpassung der Gensequenz eines Proteins an das zellfreie E. coli Expressionssystem einen positiven Effekt auf die Expressionsrate haben kann. Dazu wurden von der Firma GENEART hergestellte Varianten des HIV-Capsidproteins p24 verwendet, die entweder die originale Virussequenz, eine auf die humanen Gegebenheiten hin optimierte Version und vor allem eine auf die Anwendung in E. coli hin optimierte Version verwendet. Dabei konnte festgestellt werden, dass eine Optimierung der Gensequenz deutliche Vorteile bei der Expression erbringt. Darüberhinaus wurde p24 an verschiedenen Stellen mit einer optimierten PTD-Domäne versehen. Die Variante des p24, die N-terminal mit einer PTD Domäne fusioniert wurde, konnte als optimal exprimierend und optimal in menschliche Zellen transduzierend beschrieben werden und ist somit der ideale Kandidat für die Etablierung einer Diagnoseprozedur für eine Vakzinierung gegen HIV.
Weiterhin wurden Wege gesucht, um amyloid-beta Peptide im zellfreien System zu exprimieren. Nachdem festgestellt wurde, dass die Peptide alleine nicht nachweisbar exprimieren, wurden Alternativen gesucht. Die Anwendung von relativ kurzen Fusionstags N-terminal am Peptid erbrachte eine nachweisbare Expression. Je länger dieser Fusionspartner war, umso mehr Peptid konnte im Westernblot detektiert werden. Die Fusion von amyloid-beta Peptid mit CAT oder GST erbrachte hohe Ausbeuten. Die Präparation des Peptids ausgehend von diesen Fusionsproteinen konnte erfolgreich durchgeführt werden. Dazu wurde das Protein rückgefaltet und das Peptid durch Verdau mit TEV-Protease beinahe quantitativ freigesetzt. Die abschließende Aufreinigung durch Ni2+ Chelatchromatographie und RP-HPLC konnte das Peptid in Reinform darstellen, jedoch mit sehr hohem Verlust.
Zusammenfassend betrachtet, konnte im Rahmen der Arbeit ein tieferes Verständnis der Funktion der bakteriellen Kälteschockproteine erreicht werden, sowie durch Genoptimierung eine Erhöhung der Expressionsrate von bestimmten Proteinen durchgeführt werden. Weiterhin wurde eine Methode entwickelt, um in einem System der zellfreien Proteinexpression stark aggregierende Peptide herstellen zu können.
Translation of the abstract (English)
In the course of time, cell free protein expression, primarily used for the discovery of the genetic code, has developed from a method of fundamental research to a reasonably applicable method. Responsible for this was on the one hand the development of highly active lysates especially of E.coli or of wheat germ, and on the other hand the use of efficient transcription systems based on viral ...
Translation of the abstract (English)
In the course of time, cell free protein expression, primarily used for the discovery of the genetic code, has developed from a method of fundamental research to a reasonably applicable method. Responsible for this was on the one hand the development of highly active lysates especially of E.coli or of wheat germ, and on the other hand the use of efficient transcription systems based on viral polymerases and the establishment of efficient energy regeneration systems. Thus it became possible to generate different proteins in large amounts. But this method has the problem that many proteins can only be expressed in insufficient amounts. This is, among other problems, due to the inaccessibility of free mRNA and the codon usage. Therefore methods of enhancing the protein expression of selected proteins using E.coli lysates were investigated in this work.
It was attempted to alterate on the one hand the expression system itself and on the other hand the protein of interest to the properties of the E.coli based system.
During adaptation of the system itself it was tried to reduce the level of mRNA secondary structures by addition of cold shock proteins that are regarded as RNA Chaperones. These hairpin loops can be responsible for the inaccessibility of regulatory sequences like promoters to the ribosomal system and therefore this mRNA cannot be translated. In contrast to this widely accepted hypothesis it could be shown for the expression of CAT or Ras that by the titration of CSPs no enhancement, but inhibition of this reaction can be detected. Exhaustive studies resulted that transcription as well as translation are affected from this inhibition and that the effect described is based upon the nucleotide binding properties of the CSPs. Hence one can draw the conclusion that cold shock proteins do not have a general RNA chaperone activity as described in literature.
Furthermore it was investigated whether the adaptation of the gene sequence of a protein to the E.coli cell free expression system can have a positive effect on the expression rate. Therefore variants of the HIV capsid protein p24 were generated by GENEART that use either the original viral sequence, or a sequence optimized for the human situation or a sequence optimized for the use in an E.coli based system.
It was found out that an optimization of the gene sequence results in an advantageous expression. Furthermore p24 was fused with a PTD domain at different locations. The variant of p24 fused N-terminally with the PTD domain could be figured out as optimally expressing and optimally transducting into human cells and is therefore the ideal candidate for the establishment of a diagnostic procedure for a vaccination against HIV.
Furthermore it was looked for possibilities to get the amyloid beta peptides expressed in a cell free system. After recognising that an expression of the peptides alone cannot be detected, alternative strategies were established. The use of relatively short fusion tags on the N-terminus resulted in a detectable level of expression. The longer the fusion tag, the more expression could be observed by western blotting. The fusion of the amyloid beta peptide to CAT or GST resulted in high yields. The preparation of the peptide based on these fusion constructs could be performed successfully. Therefore the protein was refolded and the peptide was released almost quantitatively by digestion with TEV protease. The final purification via Ni2+ chelate chromatography and RP-HPLC could provide the pure peptide, but with very high losses during purification.
Concluding, this work provides a deeper understanding in the function of bacterial cold shock proteins. In this work the expression level of specific proteins could be elevated due to gene optimizations. Furthermore a method was developed for the expression of highly aggregating peptides in a system of cell free protein expression.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:49
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