Herrig, Wolfgang Alexander
(2008)
Wechselwirkung von Ezrin mit PIP2-haltigen artifiziellen Membransystemen und mit F-Aktin.
PhD, Universität Regensburg.
Date of publication of this fulltext: 22 Jul 2008 16:13
Abstract (German)
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Adsorptionsverhalten von Ezrin an und seine laterale Organisation auf Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2)-haltigen Membranoberflächen mittels Quarzmikrowaage (QCM)-Technik und Rasterkraftmikroskopie (SFM) charakterisiert und quantifiziert. Für die QCM-Messungen wurden auf einer Goldelektrode eines 5 MHz-Schwingquarzes festkörperunterstützte Membranen, ...
Abstract (German)
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Adsorptionsverhalten von Ezrin an und seine laterale Organisation auf Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2)-haltigen Membranoberflächen mittels Quarzmikrowaage (QCM)-Technik und Rasterkraftmikroskopie (SFM) charakterisiert und quantifiziert. Für die QCM-Messungen wurden auf einer Goldelektrode eines 5 MHz-Schwingquarzes festkörperunterstützte Membranen, bestehend aus einer Oktanthiol (OT)-Monoschicht und einer zweiten 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC)-Monoschicht mit variierenden PIP2-Gehalten immobilisiert. So konnte zum einen die Spezifität von Ezrin für PIP2 nachgewiesen werden, zum anderen adsorbierte, einhergehend mit einer höheren PIP2-Konzentration, eine größere Menge Protein an die Membran. Im Gegensatz hierzu konnte die Bindung an reine POPC-Membranen nicht beobachtet werden. Eine detaillierte Betrachtung der Kinetik und der Reversibilität der Ezrinadsorption zeigte, dass ein Großteil des Proteins irreversibel an die Membran adsorbiert. Auf topographischen Aufnahmen ist zu erkennen, dass Ezrin in Form von zweidimensionalen Proteindomänen, die ein zeitabhängiges Wachstum zeigen, an die Membran bindet. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde eine laterale Interaktion der Ezrinmoleküle auf der Oberfläche postuliert. Unter der Annahme, dass der Bindungsprozess auf einer positven Kooperativität der Ezrinmoleküle basiert, war es möglich, Adsorptions- und Desorptionskinetiken mittels eines von Allen P. Minton entwickelten Modells zu simulieren. Zusätzlich wurde aus den kinetischen Daten die Adsorptionsisotherme der Ezrinbindung generiert und daraus die Bindungskonstante KAds = 108 M-1 bestimmt.
Basierend auf diesen Resultaten wurden in einem zweiten Schritt mögliche Aktivierungswege von Ezrin untersucht. Hierbei wurde zunächst die Wechselwirkung von Ezrin mit S100P untersucht, das eine mögliche Aktivierung von Ezrin induzieren könnte. Allerdings war eine Interaktion der beiden Proteine mittels Vesikelassays und QCM-Messungen nicht nachzuweisen.
Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie konnte erstmals gezeigt werden, dass eine Aktivierung von Ezrin nur durch die Interaktion des Proteins mit PIP2 stattfinden kann. Hierzu wurde Ezrin entweder an PIP2-haltige oder, über dessen His-Tag, an Ni2+-1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-([N(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiessigsäure]Succinyl) (Ni-NTA-DOGS)-haltige Membranen adsorbiert und mit fluoreszenzmarkierten Aktinfilamenten inkubiert. Nur auf den PIP2-haltigen Membranen wurden fluoreszenzmarkierte Filamente beobachtet, was die Aktivierung von Ezrin durch PIP2 beweist. Mittels Pixelanalyse wurde ein Belegungsgrad der Aktinfilamente von (24 ± 18) % für eine mit Ezrin belegte POPC / PIP2 (9:1)-Membran und von (0,3 ± 0,2) % für eine mit Ezrin belegte DOPC / Ni-NTA-DOGS (9:1)-Membran bestimmt.
Translation of the abstract (English)
The aim of this study was to characterize and quantify the adsorption process and the lateral organisation of ezrin on phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) containing solid-supported membranes by means of quartz crystal microbalance (QCM) and scanning force microscopy (SFM). An increase in the PIP2 content in 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) bilayers resulted in an ...
Translation of the abstract (English)
The aim of this study was to characterize and quantify the adsorption process and the lateral organisation of ezrin on phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) containing solid-supported membranes by means of quartz crystal microbalance (QCM) and scanning force microscopy (SFM). An increase in the PIP2 content in 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) bilayers resulted in an increased amount of bound ezrin showing the specificity of ezrin for PIP2. No ezrin adsorption to membranes composed of pure POPC was detected. QCM-measurements revealed that the majority of the protein binds irreversibly to PIP2-doped membranes, which might be a result of lateral interactions between ezrin molecules. Time-elapsed SFM images show the two-dimensional growth of protein domains starting from a few nucleation sites, stressing the idea of a cooperative adsorption of ezrin on membranes doped with PIP2. Taking lateral interactions into account, it was possible to simulate adsorption and desorption kinetics obtained from time-resolved QCM readouts by employing a model developed by Allen P. Minton. In addition, on the basis of the kinetic analysis it was possible to reconstruct the adsorption isotherm with a binding constant KAds = 108 M-1.
The second aim of this study was to investigate the activation process of ezrin resulting in the unmasking of the actin-binding site in the C-terminal domain. One possible activation pathway is discussed to be based on the interaction of ezrin with S100P in a Ca2+-dependent manner. The results of this study however, do not indicate any specific interaction between the two proteins.
By means of fluorescence microscopy it was shown, for the first time that ezrin is activated only through binding to PIP2. The capability of ezrin to bind fluorescently-labeled actin filaments was investigated after adsorption of the protein to PIP2and Ni-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-([N(5-amino-1-carboxypentyl)iminodi acetic acid]succinyl) containing membranes. Respectively, fluorescently-labeled F-actin structures were only detected in the case of adsorption of ezrin to PIP2 containing membranes, indicating the conformational change from the dormant to the active state. By means of pixel analysis the coverage of actin filaments was determined to (24 ± 18) % for an ezrin saturated POPC / PIP2 (9:1) membrane and to (0,3 ± 0,2) % for an ezrin saturated DOPC / Ni-NTA-DOGS (9:1) membrane.
Export bibliographical data
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
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| Date: | 21 July 2008 |
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| Referee: | Claudia (Prof. Dr.) Steinem |
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| Date of exam: | 29 June 2007 |
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| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik |
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| Keywords: | Actin-Filament , Proteine , Wechselwirkung , Inositphosphatide , Ezrin , PIP2 , ezrin , PIP2 , F-actin |
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| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
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| Status: | Published |
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| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
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| Created at the University of Regensburg: | Yes |
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| Item ID: | 10674 |
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