BLUF domains are light sensors of many microorganisms. They are present in the multi-domain proteins e.g. AppA from the phototrophic proteobacterium Rhodobacter sphaeroides, YcgF from Escherichia coli, PAC (photoactive adenylyl cyclase) from the unicellular flagellate Euglena gracilis and single domain proteins e.g. BlrB from Rhodobacter sphaeroides, Slr1694 from cyanobacterium Synechocystis sp.PCC6803, and Tll0078 of the thermophilic unicellular cyanobacterium Thermosynechococcus elongates BP-1.
In this work the photo-cycle dynamics of BLUF domain proteins: AppA and BlrB from R. sphaeroides, Slr1694 from cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 and the H44R mutant of AppA protein in which His44 is replaced with Arg are investigated by absorption and emission spectroscopy.
The chromophore analysis of the studied proteins revealed the presence of non-covalently bound FMN, FAD and Riboflavin, in the protein binding packet.
Formation of an intermediate state (signalling-state) upon blue-light exposure was observed for all the studied BLUF domains. The signalling-state is distinguished from the receptor state by a slightly red-shifted absorption spectrum.
The efficiency of the signalling-state formation varies between 25% for AppA and 60% for Slr1694 proteins.
The signalling-state recovered back to the dark-state in dark at room temperature. The measured recovery times are between 17 min for AppA and 2 sec for BlrB. Two photo-active conformations with fast and slow fluorescence decay times in the dark- and signalling-states are observed in fluorescence lifetime measurements.
Moreover, except in AppA protein, the fluorescence lifetime measurements revealed the presence of a fraction of flavin not bounded to the protein at the room temperature (thermodynamic equilibrium between holo-protein, apo-protein and free flavin).
The photo-excitation of AppA protein in the signalling-state caused no more changes in the absorption spectrum while prolonged light excitation of BlrB and Slr1694 proteins resulted in the formation of flavin semi-quinone and flavin-hydroquinone forms followed by flavin re-oxidation and irreversible photo-degradation of free flavin and non-covalently bond flavin (with lower efficiency).

In vielen Mikroorganismen finden sich BLUF-Domänen als Photorezeptoren. Sie sind in Multidomänen-Proteinen wie AppA im fototrophen Eiweißbakterium Rhodobacter sphaeroides, YcgF in Escherichia coli, PAC (photoactive adenylyl cyclase) im Einzeller Euglena gracilis oder Einfachdomänen-Proteinen wie BlrB in Rhodobacter sphaeroides, Slr1694 im cyanobakterium Synechocystis sp.PCC6803 sowie Tll0078 in dem thermophilen einzelligen cyanobakteriums Thermosnechococcus elongates BP-1 enthalten.
In dieser Arbeit wird die Dynamik des Photozyklus von Proteinen mit BLUF-Domänen mit Hilfe von absorptions- und emissionsspektroskopischen Verfahren untersucht. Im Einzelnen werden AppA und BlrB aus R. Sphaeroides, Slr1694 aus dem cyanobakterium Synechocystis sp. PCC6803 und der H44R-Mutation des AppA-Proteins, in dem His44 durch Arg ersetzt ist, betrachtet.
Die Analyse der untersuchten Proteine hat gezeigt, dass nicht kovalent gebundenes FMN, FAD und Riboflavin in der Bindungstasche des Proteins als Chromophor wirkt.
Die Formierung eines Zwischenzustandes (Signalzustandes) durch Einstrahlung von blauem Licht wurde bei allen untersuchten BLUF-Domänen beobachtet. Der Signalzustand kann vom Rezeptorzustand durch ein leicht rotverschobenes Absorptionsspektrum unterschieden werden.
Der Anteil des generierten Signalzustandes beträgt zwischen 25% bei AppA und 60% bei Slr1694-Proteinen.
Der Signalzustand geht bei Dunkelheit und Raumtemperatur wieder in den Rezeptorzustand über, wobei die gemessene Erholungsdauer zwischen 17 Minuten für AppA und 2 Sekunden für BlrB beträgt. Zwei photoaktive Formen mit schnellen und langsamen Fluoreszenzabklingzeiten im Dunkel- und im Signalzustand wurden durch Messung der Fluoreszenzlebensdauern beobachtet.
Außerdem zeigten die Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bei den untersuchten Proteinen mit Ausnahme von AppA-Proteinen das Vorhandensein von nicht an Proteine gebundenem Flavin bei Raumtemperatur (thermodynamisches Gleichgewicht zwischen Holoprotein, Apoprotein und ungebundenem Flavin).
Die Bestrahlung mit Licht im Signalzustand verursacht beim AppA-Protein keine weiteren Veränderungen im Absorptionsspektrum, während länger andauernde Bestrahlung bei BlrB- und Slr1694-Proteinen zu einer Bildung von Flavin in der Semiquinone- und Hydroquinone-Form führt, welcher einer Reoxidation von Flavin sowie irreversible Photodegradation von ungebundenem und nicht kovalent gebundenem Flavin folgt (mit einer geringeren Effizenz).