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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-9748
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10737
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 13 May 2008 |
| Referee: | Michael (Prof. Dr.) Thomm |
| Date of exam: | 2 April 2008 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) > Prof. Dr. Michael Thomm |
| Keywords: | Resistenz , Escherichia coli , In vivo , Fluorchinolone , Salizylat , resistance , Escherchia coli , in vivo , fluoroquinolone , salicylate |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10737 |
Abstract (German)
Die bakterielle Resistenzentwicklung stellt in der Humanmedizin ein zunehmendes Problem dar. In vivo-Modelle sind für die Untersuchung dieser Resistenzentwicklung von Mikroorganismen notwendig, da hier die Situation in einem Patienten simuliert werden kann. Mit Hilfe eines Mini-Tn10-Transposon-Systems wurde ein E. coli mit green fluorescent protein (gfp), das unter der Kontrolle des ...
Abstract (German)
Die bakterielle Resistenzentwicklung stellt in der Humanmedizin ein zunehmendes Problem dar. In vivo-Modelle sind für die Untersuchung dieser Resistenzentwicklung von Mikroorganismen notwendig, da hier die Situation in einem Patienten simuliert werden kann.
Mit Hilfe eines Mini-Tn10-Transposon-Systems wurde ein E. coli mit green fluorescent protein (gfp), das unter der Kontrolle des araB-Promotors steht, und einer Kanamycin-Resistenzkassette chromosomal markiert. Der daraus hervorgegangene Klon E. coli-57 zeigte im Vergleich zu seinem Wildtyp E. coli-4 keine phänotypische Veränderung. Der Integrationsort der Markierung in das Genom von E. coli-57 konnte nicht festgestellt werden.
Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Resistenzentwicklung des E. coli-57 gegen Fluorchinolone in vivo untersucht werden. Hierfür wurde der Rattendarm mit dem E. coli-57 kolonisiert und dieser war ohne Antibiose kulturell über sechs Monate lang stabil nachweisbar. Die orale Gabe des Antibiotikums Ciprofloxacin über drei Tage verursachte bei E. coli-57 einen Verlust des gfp-Gens. Rep-PCR und die Ergebnisse des Southern Blot zeigten, dass die entstandenen Klone mit E. coli-57 verwandt sind. Die Klone zeigten im Vergleich zu E. coli-57 keine Veränderung der Minimalen Hemmkonzentration gegen Ciprofloxacin.
Multiresistenz ist das Ergebnis des Zusammenwirkens von spezifischen Mechanismen und Uptake-/Efflux-Vorgängen durch multi drug resistance (MDR)-Transporter. Bisher sind wenige Substanzen bekannt, die als so genannte Induktoren eine Änderung der Expression von MDR-Transportsystemen verursachen (z. B. Azetylsalizylsäure).
Aufgrund dessen war ein weiteres Ziel der Arbeit die systematische Identifikation pharmakologischer Substanzen als Co-Medikation von Antibiotika, die Expressionssteigerungen von spezifischen MDR-Transportern auslösen.
Für das Screening potentieller Induktoren wurden Reporterstämme generiert, die einen Vektor mit dem gfp-Reportergen unter der Kontrolle von jeweils einem Promotor der sieben bekannten Fluorchinolon-Pumpen tragen.
Neben Azetylsalizylsäure wurden Ibuprofen, Ketoprofen, Paracetamol und die jeweiligen Lösungsmittel der Substanzen (100 %iger Ethanol oder 70 %iger Ethanol) auf induktive Wirkung hin untersucht.
Azetylsalizylsäure, Paracetamol und 70 %iger Ethanol zeigten einen induktiven Effekt sowohl auf die Transkription von acrAB als auch auf die marRA-Transkription. Bei 100 %igem Ethanol zeigte sich ein induktiver Effekt auf die marRA-Transkription, jedoch kein induktiver Effekt auf die acrAB-Transkription.
Eine Steigerung der Expression von acrD war bei allen fünf Substanzen zu beobachten. Eine Induktion des acrEF-Promotors oder des norE-Promotors war bei keiner der genannten Substanzen zu erkennen.
Durch Salizylat kann auch die Virulenz und Adhärenz von Keimen verändert werden. Um die Auswirkungen von unterschiedlichen Salizylatkonzentrationen (5 mM�20 mM) auf E. coli zu untersuchen sollte die Adhärenz in der Zellkultur untersucht werden. Außerdem sollten die Expressionsänderungen von Adhärenz (sfaD/E, motB)und Virulenzgenen (hlyE) mittels Real-Time-PCR (RT-PCR) untersucht werden. Die bei dieser Untersuchung verwendeten E. coli-Stämmen E. coli 1173 und E. coli 1267 zeigten bei einer Verwandtschaft unterschiedliche MHK (4 mg/l versus 256 mg/l) gegenüber Ciprofloxacin. Eine Erhöhung der Salizylatkonzentration verursachte bei E. coli 1173 eine Abnahme und bei E. coli 1267 keine Abnahme der Adhärenz. Es konnte keine Veränderung in der Transkription der Gene hlyE (Hämolysin), sfaD/E (S-Fimbrien) und motB (Motilität) in Abhängigkeit von der Salizylatkonzentration beobachtet werden.
Translation of the abstract (English)
The bacterial resistance development shows an increasing problem in human medicine. In vivo models are useful for the investigation of this resistance development in micro-organisms because the situation in a patient can be simulated. Using a mini-Tn10 transposon delivery system, we have chromosomally labelled an E. coli with a green fluorescent protein gene (gfp) controlled by the araB-promoter ...
Translation of the abstract (English)
The bacterial resistance development shows an increasing problem in human medicine. In vivo models are useful for the investigation of this resistance development in micro-organisms because the situation in a patient can be simulated.
Using a mini-Tn10 transposon delivery system, we have chromosomally labelled an E. coli with a green fluorescent protein gene (gfp) controlled by the araB-promoter and a kanamycin-resistance cassette. The resulting labelled E. coli-57 showed no phenotypic changes in comparison to the wild type E. coli-4. The integration locus of the marker within the genome could not be ascertained.
In the second part of the work resistance development against fluoroquinolone was examined in vivo. For this the rat's bowel was populated with E. coli-57 and it was culturable without antibiosis from the excrement for more than six months. The oral administration of the antibiotic ciprofloxacin for three days caused a loss of the gfp in E.coli-57. Rep-PCR and the results of a Southern Blot showed that the yielded clones are related to E. coli-57. These clones revealed no change in MIC against ciprofloxacin.
Multi-resistance is the result of co-action between specific mechanisms and uptake-/efflux-processes by multi-drug resistance (MDR)-transporters. Until now there are only some substances known to be inducers of these MDR-transporters (e.g. acetylsalicylic acid). Therefore, the second aim of this work was to identify other substances which increase the expression of MDR-transporters. For the screening of potential inducers, reporter strains were generated which carry a vector with the gfp controlled by an efflux-pump promoter.
Acetylsalicylic acid, ibuprofen, ketoprofen, paracetamol and ethanol were tested for inductive effects. Acetylsalicylic acid, paracetamol and ethanol (70 %) showed an inductive effect on acrAB- and marRA-transcription. 100 % ethanol induced the expression of MarRA, but there was no effect on AcrAB-expression. All five substances tested showed an inductive effect on acrD.
Salicylate has an effect on virulence and adherence of bacteria. In order to test the effects of different concentrations of salicylate (5 mM-20 mM) on E. coli, cell-adhesion-assays were performed. The tested E. coli-strains, 1173 and 1267, were related to each other but they had different MICs (4 mg/l versus 256 mg/l) against ciprofloxacin. The results showed a decrease in adhesion of E. coli 1173 and an increase in adhesion of E. coli 1267 with increasing salicylate concentration. No change could be observed in the transcription of the genes hlyE (hemolysin), sfaD/E (S-fimbriae) and motB (motility).
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:29
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