Im menschlichen Genom treten sogenannte Einzelnucleotid-Punktmutationen (SNP = single nucleotide polymorphism) auf, die eine große individuelle genetische Variabilität verursachen. Diese Punktmutationen können zur Entstehung von schwerwiegenden Krankheiten führen. Neben den bereits bekannten enzymatischen und nicht-enzymatischen SNP-Detektionsmethoden, wurde in der Arbeitsgruppe Wagenknecht das DETEQ-Konzept (Detection by electron transfer-controlled emission quenching) zur Erkennung von Basenfehlpaarungen entwickelt. Es basiert auf Ladungstransfer durch die DNA. Für die Anwendung dieses Konzepts ist es nötig, dass redoxaktive Fluorophore in Oligonucleotidsonden eingebaut werden. Wird zusätzlich ein geeigneter Ladungsakzeptor eingebaut, so kann es nach Hybridisierung der Sonde mit der Zielsequenz zu Elektronenübertragungen durch die DNA-Brücke kommen. Da der Ladungstransfer von der elektronischen Kopplung abhängt, die von der Basenstapelung vermittelt wird, ändert sich die Ladungstransferrate beim Auftreten einer Basenfehlpaarung in der DNA-Brücke zwischen Fluorophor und Ladungsakzeptor. Es tritt folglich eine veränderte Fluoreszenz im Vergleich zum Wildtyp auf, die zur Detektion von SNPs genutzt werden kann. In dieser Arbeit wurde das DETEQ-Konzept für neuartige Donor-Akzeptor-Systeme überprüft. Dazu wurden die Fluoreszenzsonden Pyren und Ethidium als Ladungsdonoren kovalent in Oligonucleotide eingebaut. Als Ladungsakzeptor wurde Indol verwendet. Ethidium und Indol wurden als acyclische Basensurrogate in die Oligonucleotidsequenzen eingebaut, während Pyren als Guaninmodifikation eingebracht wurde.

Des Weiteren wurde 5-(2-Pyrenyl)-2�-desoxyuridin (2PydU), ein neuer nucleosidischer Elektronendonor auf der Basis von Pyren, entwickelt. Anhand spektroskopischer Untersuchungen des Nucleosids konnte eine sehr geringe elektronische Kopplung zwischen den beiden Chromophoren beobachtet werden, die zu neuen optischen Eigenschaften führt. Die Eigenschaft als Elektronendonor wurde in Experimenten mit 2PydU-Dinucleotiden erforscht. Die spektroskopische Analytik von 2PydU-modifizierten Oligonucleotiden erlaubten die Diskriminierung der Gegenbase A.

Beim enzymatischen Einbau fluoreszenzmarkierter DNA-Basen werden Fluorophore oft über Alkylketten-Linker angeknüpft, um die Replikation durch DNA-Polymerasen zu ermöglichen. In der Arbeitsgruppe Wagenknecht werden die Fluorophore direkt kovalent mit den DNA-Basen verbunden, um neue optische Eigenschaften zu erzeugen. Daher sollte die Frage geklärt werden, ob solche direkt an DNA-Basen geknüpfte Modifikationen von DNA-Polymerasen erkannt werden, um herauszufinden, ob sie als Fluoreszenzmarker in der DNA-Analytik eingesetzt werden könnten. Dazu wurden verschiedene modifizierte DNA-Basen in Primerverlängerungs-Experimenten untersucht, um herauszufinden, welche Gegenbasen die DNA-Polymerasen zur jeweiligen Modifikation insertieren. Als DNA-Polymerasen wurden Pol ß, Dpo4 und KF(exo-) verwendet.

SNPs (single nucleotide polymorphism) cause a great individual genetic variability in the human genome. Such SNPs can lead to several diseases. There are enzymatic and non enzymatic methods of SNP detection known. In the workgroup of Prof. Wagenknecht a new concept based on DNA-mediated charge transfer was developed: the DETEQ concept (Detection by electron transfer-controlled emission quenching). For this concept it is necessary to incorporate a redox active fluorophore into an oligonucleotide probe. If there is a suitable acceptor available DNA mediated charge transfer can take place after hybridizing with the target strand. Charge transfer is depending on the electronic coupling between the DNA bases. Base mismatches between donor and acceptor change the charge transfer rates and therefore altered emission intensities can be detected. In this work the DETEQ concept was verified for different donor acceptor systems. As charge donors pyrene and ethidium were covalently incorporated into DNA. Indole was used as charge acceptor. Ethidium and indole were incorporated as acyclic base surrogates, pyrene was used as guanine modification.

Furthermore, 5-(2-Pyrenyl)-2�-deoxyuridine (2PydU) was developed as a new nucleosidic electron donor. A very low electronic coupling between both chromophores could be shown by spectroscopic measurements of the nucleoside. Electron donating properties were explored in experiments with 2PydU dinucleotides. Spectroscopic analytics of 2PydU-modified oligonucleotides allowed the discrimination of A as counter base.

For replication by DNA polymerases fluorophores are mostly attached via an alkyl chain linker to the DNA bases. In the workgroup of Prof. Wagenknecht the chromophores are directly covalent connected to the DNA bases to develop new optical properties. Therefore the question occurs if such modifications can be recognized by DNA polymerases. Otherwise they could not be used as fluorescent markers in DNA analytics. The last part of this work deals with primer extension experiment with different modified DNA bases. As polymerases Pol ß, Dpo4 and KF(exo-) were used.