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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-9490
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.12104
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 22 Januar 2009 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Michael (Prof. Dr.) Thomm |
| Tag der Prüfung: | 5 März 2008 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) > Prof. Dr. Michael Thomm |
| Stichwörter / Keywords: | Biochemie , Molekularbiologie , RNS-Polymerase II , RNS-Polymerase III , Archaebakterien , Transkription <Genetik> , Pyrococcus furiosus , , biochemistry , molecular biology , RNA polymerase II , RNA polymerase III , archaea |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 12104 |
Zusammenfassung (Englisch)
Novel mechanistic properties of the archaeal transcription system that reveal similarities especially to the eukaryotic RNA polymerase II and III systems were presented in thesis. The in vitro transcription system from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus provided the basis for the studies of the archaeal transcription cycle in the present work. To obtain a detailed view on the ...
Zusammenfassung (Englisch)
Novel mechanistic properties of the archaeal transcription system that reveal similarities
especially to the eukaryotic RNA polymerase II and III systems were presented in thesis. The
in vitro transcription system from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus
provided the basis for the studies of the archaeal transcription cycle in the present work.
To obtain a detailed view on the dimensional parameters of the archaeal RNA polymerase
during the transition from initiation to elongation, transcription complexes were paused in
several registers from +5 to +20 by the use of C-minus cassettes. Exonuclease III footprinting
analyses showed the RNA polymerase in close contact to the transcription factors TBP and
TFB until a first structural transition in registers +6/+7 leads to a detectable upstream end of
the RNAP. A second structural transition, observed in registers +10/+11, is characterized by
bubble reclosure in the upstream part of the initially melted region and the first movement of
the RNA polymerase downstream edge. RNA synthesis proceedes synchronously in early
elongation between registers +11 and +20. The size of the transcription bubble in early
elongation complexes is around 16 nucleotides and the RNA-DNA hybrid is about 9 bp in
length. The RNA polymerase covers 26-29 bp of DNA and the distance of the catalytic center
to the front edge of the RNA polymerase is approximately 12 bp.
Based on structural data on the eukaryotic RNA polymerase II, a structure-function analysis
of Pyrococcus furiosus RNA polymerase mutants was performed. It elucidated the influence
of structural polymerase elements on different stages of the transcription cycle. Recombinant
archaeal RNA polymerases each carrying a deletion of one of four prominent cleft loops,
named lid, rudder, fork1 and fork2, and three other RNAPs with point mutations were
analysed. The delta rudder enzyme was demonstrated to be defective in open complex formation
indicating an important role of the rudder loop in strand separation and/or maintainence of the
transcription bubble. Experiments with templates containing a mismatch bubble resulted in
predominant transcripts of 11 and 12 nucleotides. It could be demonstrated that a minimal
length of 27 nt downstream of the bubble is required for promoter escape and transcription
past the barrier.
The complete archaeal histone gene from Pyrococcus furiosus with its adjacent four
consecutive oligo-dT streches was used as a model system to address the question of
termination mechanisms in hyperthermophilic Archaea. At 90°C the archaeal RNA
polymerase terminated with high efficiency at the first oligo-dT sequence when it contains at
least 5 T residues. Possible hairpin formation has no influence on termination efficency.
Template competition experiments revealed the existence of a pol III-like terminationdependent
reinitiation mechanism in the archaeal transcription system. Mutations of the
sequences immediately downstream of the first termination signal dramatically affect the
reinitiation mechanism.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die vorliegende Arbeit führt zu neuen Einblicken in den Mechanismus des archaeellen Transkriptionssystems und offenbart Ähnlichkeiten insbesondere zu den eukaryotischen RNA Polymerase II und III Systemen. Das in vitro Transkriptionssystem des hyperthermophilen Archaeons Pyrococcus furiosus bildete die Grundlage für die Untersuchung des archaeellen Transkriptionszyklus in dieser Arbeit. Um ein ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die vorliegende Arbeit führt zu neuen Einblicken in den Mechanismus des archaeellen
Transkriptionssystems und offenbart Ähnlichkeiten insbesondere zu den eukaryotischen RNA
Polymerase II und III Systemen. Das in vitro Transkriptionssystem des hyperthermophilen
Archaeons Pyrococcus furiosus bildete die Grundlage für die Untersuchung des archaeellen
Transkriptionszyklus in dieser Arbeit.
Um ein detailiertes Bild von den strukturellen Eckdaten einer archaeellen RNA Polymerase
während des Übergangs von der Initiation zur Elongation zu erhalten, wurden
Transkripitonskomplexe in verschieden Registern zwischen +5 und +20 mit Hilfe von Cminus
Kassetten pausiert. Die Analyse der pausierten Komplexe mit Exonuklease III zeigte,
dass die RNA Polymerase in engem Kontakt zu den Transkriptionsfaktoren TBP und TFB
steht, bis ein erster struktureller Übergang in den Registern +6/+7 ein Ablösen der RNAP von
den Faktoren erkennen lässt. Das Schließen der Transkriptionsblase im stromaufwärts
gelegenen Bereich der initial geöffneten Region und eine erste Vorwärtsbewegung des
vorderen Endes der RNA Polymerase charakterisieren einen zweiten strukturellen Übergang
in den Registern +10/+11. Zwischen den Registern +11 und +20 der frühen Elongationsphase
läuft die RNA Synthese synchron. Im frühen Elongationskomplex hat die Transkriptionsblase
eine Ausdehnung von etwa 16 Nukleotiden und das RNA-DNA Hybrid ist ungefähr 9 bp lang.
Die RNA Polymerase Bindestelle umfasst 26-29 bp der DNA und der Abstand vom aktiven
Zentrum zum stromabwärts gelegenen Ende der RNA Polymerase beträgt etwa 12 bp.
Eine auf Strukturdaten der eukaryotischen Polymerase II beruhende Struktur-Funktions-
Analyse von Pyrococcus furiosus RNA Polymerase Mutanten beleuchtete den Einfluß
struktureller Elemente der RNA Polymerase auf verschiedene Phasen im Transkriptionszyklus.
Rekombinante archaeelle RNA Polymerasen, von denen jede eine Deletion einer der
vier aus der RNA Polymerase Spalte hervorstehende Schleifen, lid, rudder, fork1 und fork2,
trug sowie drei andere RNA Polymerasen mit Punktmutationen wurden untersucht. Es konnte
gezeigt werden, dass das delta rudder Enzym keinen offenen Komplex ausbilden konnte, was auf
eine wichtige Rolle dieser Struktur in Strangtrennung und/oder Erhaltung der Transkriptionsblase
hindeutet. Experimente mit einer Matrize, die einen vorgeöffneten Promotor enthält,
brachten hauptsächlich vorzeitig abbrechende Transkripte von 11 und 12 Nukleotiden Länge
hervor. Es konnte gezeigt werden, dass eine minimale Länge von 27 bp der DNA
stromabwärts des Heteroduplexbereichs benötigt wird, damit die RNA Polymerase diese
Barriere überwinden und Transkripte mit voller Länge synthetisieren kann.
Das komplette archaeelle Histon-Gen hpyA1 von Pyrococcus furiosus, mit seinen
nachfolgenden vier oligo-dT Sequenzen direkt stromabwärts des Gens, wurde als
Modellsystem verwendet, um den Mechanismus der transkriptionellen Termination bei
hyperthermophilen Archaeen zu untersuchen. Bei 90°C terminiert die archaeelle RNA
Polymerase mit hoher Effizienz an der ersten oligo-dT-Sequenz wenn sie mindestens 5 T
Reste enthält. Die mögliche Ausbildung einer Haarnadelstruktur hat keinen Einfluß auf die
Terminationseffizienz. Die Existenz eines RNA polymerase III-ähnlichen terminationsabhängigen
Reinitiations-mechanismus im archaeellen Transkriptionssystem konnte durch
Kompetitionsexperimente mit pausierten Komplexen aufgedeckt werden. Mutationen der
Sequenzen direkt stromabwärts der Terminationssignale haben einen entscheidenden Einfluß
auf den postulierten Reinitiationsmechanismus.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 11:23
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