Etablierung transgener Zelllinien zur Visualisierung der Aktivität des Doublecortin-Promotors als Modell der Neurogenese in vitro

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	2 February 2009
Referee:	Aigner (Prof. Dr.) Ludwig
Date of exam:	16 January 2009
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Neurologie
Keywords:	Neurogenese , Promotor <Genetik> , Doublecortin , DCX , Ntera , Vorläuferzellen , neuronale Determinierung , doublecortin , neurogenesis , ntera , DCX , neuronal determination
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	12110

Abstract (German)

Doublecortin (DCX) ist ein X-chromosomal kodiertes Protein, das in Zusammenhang mit der Migration neuronaler Vorläuferzellen steht. Es wird während der Embryonalentwicklung des zentralen Nervensystems und im adulten Gehirn von Säugetieren spezifisch in neuronalen Vorläuferzellen und jungen Neuronen exprimiert und ist nicht in Stammzellen oder adulten Nervenzellen nachweisbar. Dieses ...

Abstract (German)

Doublecortin (DCX) ist ein X-chromosomal kodiertes Protein, das in Zusammenhang mit der Migration neuronaler Vorläuferzellen steht. Es wird während der Embryonalentwicklung des zentralen Nervensystems und im adulten Gehirn von Säugetieren spezifisch in neuronalen Vorläuferzellen und jungen Neuronen exprimiert und ist nicht in Stammzellen oder adulten Nervenzellen nachweisbar. Dieses Expressionsmuster macht DCX zu einem einzigartigen Marker für Neurogenese.
Welche Faktoren die Expression von DCX und damit die frühe neuronale Determinierung beeinflussen, ist bisher wenig bekannt. Die weitere Erforschung der frühen Neurogenese gestaltet sich, auch aufgrund fehlender einfacher Untersuchungsmethoden in vitro, aufwendig, zeitintensiv und schwer standardisierbar.
Die vorliegende Promotion verfolgte daher das Ziel, mit Hilfe neuronaler, immortalisierter Zelllinien ein Modell der neuronalen Determinierung zu etablieren und dieses mit Hilfe von Reportersystemen der DCX-regulierenden Sequenz als Versuchsmodell nutzbar zu machen.
In dieser Dissertation konnte zum einen mit den immortalisierten, aus einem Keimzelltumor stammenden Ntera/CloneD1-Zellen nun eine Zelllinie identifiziert werden, die die neuronale Determinierung und Differenzierung unter Zugabe von Retinolsäure zu imitieren scheint und im Verlauf eine Induktion von DCX als Marker neuronaler Vorläuferzellen erfährt. So entwickelte sich nach Differenzierung mit Retinolsäure ein neuronaler Phänotyp und es konnte ein 16-facher Anstieg der DCX-mRNA Expression sowie des DCX-Proteins nachgewiesen werden. Weiterhin gelang der Nachweis einer Co-Expression mit dem neuronalen Marker Map2a/b.
In einem zweiten Schritt konnten durch eine stabile Transfektion von lumineszierenden und fluoreszierenden Reportersystemen unter der Kontrolle des DCX-Promotors in die Ntera/CloneD1-Zellen transgene Zelllinien generiert werden, die in Zellkultur den direkten Nachweis einer Induktion der neuronalen Differenzierung durch z. B. Retinolsäure ermöglichen.
Mit dieser Methode stehen nun neue und vereinfachte methodische Möglichkeiten zur Analyse der frühen Neurogenese sowie des DCX-Promotors zur Verfügung. So ermöglicht der einfache Nachweis der Neurogenese-Induktion in Zukunft ein High Throughput Screening beteiligter Wachstums- und Transkriptionsfaktoren der frühen neuronalen Differenzierung.

Translation of the abstract (English)

During developmental and adult neurogenesis, the X-chromosomal-encoded protein doublecortin is an early neuronal marker expressed when neural stem cells assume a neuronal cell fate. To understand mechanisms involved in early processes of neuronal fate decision, we first investigated cell lines for their capacity to induce expression of doublecortin upon neuronal differentiation and secondly ...

Translation of the abstract (English)

During developmental and adult neurogenesis, the X-chromosomal-encoded protein doublecortin is an early neuronal marker expressed when neural stem cells assume a neuronal cell fate. To understand mechanisms involved in early processes of neuronal fate decision, we first investigated cell lines for their capacity to induce expression of doublecortin upon neuronal differentiation and secondly developed in vitro reporter models using doublecortin promoter sequences.
Among various cell lines investigated, the human teratocarcinoma cell line NTERA-2 was found to fulfill our criteria. Following induction of differentiation using retinoic acid treatment, we observed a 16-fold increase in doublecortin mRNA expression, as well as strong induction of doublecortin polypeptide expression. The acquisition of a neuronal precursor phenotype was also substantiated by the establishment of a multipolar neuronal morphology and expression of additional neuronal markers, such as Map2.
Moreover, stable transfection in NTERA-2 cells of reporter constructs encoding fluorescent genes under the control of the doublecortin promoter allowed us to directly detect induction of neuronal differentiation in cell culture, such as following retinoic acid treatment.
Induction of doublecortin expression in differentiating NTERA-2 cells suggests that these cells accurately recapitulate some of the very early events of neuronal determination. Hence, the use of reporter genes under the control of the doublecortin promoter in NTERA-2 cells will help us to investigate factors involved early in the course of neuronal differentiation processes. Moreover the ease to detect the induction of a neuronal program in this model will permit to perform high throughput screening for compounds acting on the early neuronal differentiation mechanisms.

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