Schädigung respiratorischer Epithelzellen nach allogener Stammzelltransplantation in einem Zellkulturmodell der Graft-versus-Host Reaktion

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	8 April 2009
Referee:	Günther (Prof. Dr.) Hauska
Date of exam:	5 August 2008
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Klaus Grasser)
Keywords:	Lunge , Homotransplantation , Transplantat-Wirt-Reaktion , Cytotoxizität , Epithelzelle , Lungenschäden , Epithelzellen , stem cell transplantation , lung damage , GvHD , epithelial cell
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	12256

Abstract (German)

Die Stammzelltransplantation (SZT) ist eine gut etablierte und verbreitete Behandlungsmethode von einer Reihe lebensbedrohlicher Krankheiten, die trotz inzwischen hoher Heilungschancen immer noch häufig mit lebensbedrohlichen Nebenwirkungen verbunden ist. Aufgrund verbesserter antibiotischer Prophylaxe stehen dabei heute akute und chronische nichtinfektiös bedingte Nebenwirkungen im Vordergrund, ...

Abstract (German)

Die Stammzelltransplantation (SZT) ist eine gut etablierte und verbreitete Behandlungsmethode von einer Reihe lebensbedrohlicher Krankheiten, die trotz inzwischen hoher Heilungschancen immer noch häufig mit lebensbedrohlichen Nebenwirkungen verbunden ist. Aufgrund verbesserter antibiotischer Prophylaxe stehen dabei heute akute und chronische nichtinfektiös bedingte Nebenwirkungen im Vordergrund, die sich nicht nur an den Organen Haut, Leber und Darm, sondern sehr häufig auch an der Lunge manifestieren. Dort machen sie sich u. a. durch Entzündungsreaktionen zusammen mit einer abnormalen Lungenfunktion bemerkbar und sind histopathologisch mit einem diffusen Alveolarschaden, bronchiolärer Entzündung und Epithelschäden assoziiert. Durch die Maßnahmen des Konditionierungsregimes lassen sich diese Befunde jedoch nicht ausreichend erklären. Die direkte Beteiligung zytotoxischer Reaktionen im Sinne einer graft-versus-host disease (GvHD) könnte deshalb eine weitere Erklärungsmöglichkeit für die Entstehung nichtinfektiös bedingter Schädigungen des Lungenepithels nach allogener SZT darstellen. Deren Nachweis steht aber noch aus und war Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit.
Zur Untersuchung der Fragestellung, ob und wie solche zytotoxischen Reaktionen an der Schädigung des Lungenepithels nach allogener SZT beteiligt sind, wurden isolierte zytotoxische T-Zellen (CD8+ CD4- CD16/56-) mit respiratorischen Epithelzelllinien (BEAS-2B bzw. A549) bzw. primären bronchialen Epithelzellen (PBEC) in einem Zellkulturmodell kokultiviert. MHC I, ICAM-1 und zumindest die nichtklassischen kostimulatorischen Moleküle CD70 und CD95 wurden - im Gegensatz zu den klassischen CD80 und CD86 - als Voraussetzung zur Antigenpräsentation und T-Zell-Aktivierung auf den respiratorischen Epithelzellen exprimiert. Die in der Kokultur erhobenen Daten zeigen, dass die bronchialen Epithelzellen in vitro in der Lage waren, allogene CD8+ T-Zellen direkt und ohne professionelle Hilfe zu Zytokinproduktion (IFN-gamma), Proliferation, verstärkter Expression von Aktivierungsmarkern und einer spezifschen Zytotoxizität gegen Epithelzelltargets zu aktivieren. Diese Ergebnisse konnten sowohl mit Zellen der Linie BEAS-2B, als auch mit PBEC (IFN-gamma-Produktion und Zytotoxizität) gezeigt werden, nicht aber für A549. Die gemessene Aktivierung erwies sich als spezifsch durch die Epithelzellen (nicht z. B. durch Zytokine wie IL-2) induziert. Sowohl für die respiratorische Epithelzelllinie BEAS-2B als auch für frisch gewonnene primäre bronchiale Epithelzellen konnte damit eine "nichtprofessionelle antigenpräsentierende" Funktion nachgewiesen werden.
Die derart (allo)aktivierten CD8+ T-Zellen waren in der Lage, die entsprechenden respiratorischen Epithelzellen als Targets zu erkennen und zu zerstören. Diese gegen BEAS-2B bzw. PBEC nachweisbare Zytotoxizität war spezifsch gegen die entsprechenden Targets gerichtet und durch Granzym B vermittelt. Eine Apoptoseinduktion über FAS- oder TNF-vermittelte Signale war dagegen nicht nachweisbar. Auch sprechen die in dieser Arbeit gefundenen Ergebnisse aus Blockierungsexperimenten mit anti-MHC I-Antikörpern gegen eine MHC I-Abhängigkeit der Epithelzelllyse, eine Aussage über die MHC I-Abhängigkeit in der Aktivierungsphase erlauben diese Ergebnisse allerdings nicht. Dagegen konnte der Einfluss eines alternativen Mechanismus zur Vermittlung von Zytotoxizität aufgezeigt werden: in den Versuchsansätzen mit BEAS-2B und PBEC wurde die Lyse der Epithelzelltargets durch Blockade des Rezeptors NKG2D signifkant reduziert.
In dem Zellkulturmodell konnten also zytotoxische Reaktionen, die als typische Mechanismen einer GvHD gelten, an respiratorischem Epithel nachgewiesen werden. Humane bronchiale Epithelzellen dienten dabei sowohl als direkte Aktivatoren zytotoxischer CD8+ T-Zellen als auch als Targets für alloaktivierte CD8+ T-Zellen. Eine offenbar zentrale Rolle für die Zytotoxizität der CD8+ T-Zellen spielte hierbei die nichtklassische Signalvermittlung über NKG2D. Dies eröffnet neue Ansätze für vorbeugende Maßnahmen bzw. eine Therapie zur Reduzierung zytotoxisch bedingter Schäden des respiratorischen Epithels nach allogener SZT.

Translation of the abstract (English)

Allogeneic haematopoietic stem cell transplantation (SCT) has emerged as a curative therapeutic option. However, the role of graft-versus-host disease in lung injury after SCT has yet to be determined. In the present study, primary bronchial epithelial cells and the bronchial epithelial cell lines A549 and BEAS-2B were used in a coculture model to investigate immune responses of allogeneic CD8+ ...

Translation of the abstract (English)

Allogeneic haematopoietic stem cell transplantation (SCT) has emerged as a curative therapeutic option. However, the role of graft-versus-host disease in lung injury after SCT has yet to be determined.
In the present study, primary bronchial epithelial cells and the bronchial epithelial cell lines A549 and BEAS-2B were used in a coculture model to investigate immune responses of allogeneic CD8+ T-cells directed against respiratory epithelial cells.
The primary bronchial epithelial cells as well as the cell line BEAS-2B were able to directly activate allogeneic CD8+ T-cells in vitro without professional help so that the CD8+ T-cells produced significant amounts of interferon-gamma, upregulated alloantigen activation markers, proliferated highly and showed a specific cytotoxic activity against the epithelial cell targets (lysis).
Furthermore, cytotoxicity assays demonstrated that the cytolytic activity induced in CD8+ T-cells was directed specifically against bronchial epithelial cells and was granzyme B- but not Fas- or TNF-mediated. Generation of natural killer (NK) T-cells, NK-like T-cells, cytokineinduced killer cells or lymphokine-activated killer cells could be excluded by phenotyping, culture conditions and neglectable lytic activity following stimulation with interleukin-2 alone. Inhibition experiments showed that lysis of bronchial epithelial cells was not major histocompatibility complex-I restricted, but depended on NK group 2 member D signalling, a stimulatory receptor initially shown to be expressed on NK cells.
These data imply that the respiratory epithelium has an antigen presenting function and directly alloactivates cytotoxic CD8+ T-cells that show nonclassical effector function.

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