| License: Publishing license for publications including print on demand (9MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-156146
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.15614
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 4 May 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Burkhard König and Prof. Dr. Hans-Achim Wagenknecht |
| Date of exam: | 18 June 2010 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Organische Chemie > Lehrstuhl Prof. Dr. Burkhard König |
| Keywords: | Molecular recognition, water-soluble cholesterol, nucleotides, nucleic acids, DNA staining, protein staining, phosphorylation, protein-protein interaction, Ras Molekular Erkennung; wasserlösliches Cholesterin; Nukleotide; Nukleinsäuren; DNA Färbung; Protein Färbung, Phosphorylierung; Protein-Protein Interaktion; Ras |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 15614 |
Abstract (English)
Chapter 1 of this work deals with pyrene-excimer signalled analyte recognition of small biomolecules. Therefore, pyrene labelled Zn2+-cyclen and bis-Zn2+-bis-cyclen complexes were synthesized. The reversible coordination at physiological pH of Zn2+-cyclens to phosphate anions and to imide moieties, as present in thymine and uracil nucleotides, is well known. In the presence of analytes bearing a ...
Abstract (English)
Chapter 1 of this work deals with pyrene-excimer signalled analyte recognition of small biomolecules. Therefore, pyrene labelled Zn2+-cyclen and bis-Zn2+-bis-cyclen complexes were synthesized. The reversible coordination at physiological pH of Zn2+-cyclens to phosphate anions and to imide moieties, as present in thymine and uracil nucleotides, is well known. In the presence of analytes bearing a phosphate and an imide or two phosphate groups the formation of a ternary complex consisting of two pyrene-labelled metal complexes and the analyte molecule, was observed. The close proximity of the pyrene labels in the complex induced pyrene excimer emission, which was observable by the unarmed eye. By this, the presence of UMP, UDP, UTP and TTP in buffered aqueous solution was signalled, while other nucleotides were not able to induce excimer emission. In the same way, Zn2+-Cyclen-pyrene acted as luminescent chemosensor for PPi and Fructose-1,6-bisphosphate in aqueous buffer. In contrast, Bis-Zn2+-bis-cyclen-pyrene was found to be not as selective as the mono-nuclear complex since IDP and ITP also lead to formation of ternary complexes; moreover, UMP, PPi and Fructose-1,6-bisphosphate did not result in excimer formation.
Chapter 2 demonstrates the ability of pyrene labelled Zn2+-cyclen, which was already introduced in Chapter 1 to be a staining reagent for DNA in agarose gels. The metal chelate was found to coordinate reversibly to the DNA phosphate backbone inducing the formation of pyrene excimers. The typical pyrene excimer emission was used for the detection of the DNA. Staining was limited to agarose gels and less sensitive than Ethidium bromide, but DNA amounts down to 10 ng and short DNA strands (~300 bp) were detectable. Moreover, gel extraction as a standard technique in molecular biology was successfully performed after staining with Zn2+-Cyclen-pyrene. Finally, cytotoxicity tests on HeLa and V-79 cells reveal that the zinc-cyclen pyrene probe is significant less toxic compared to Ethidium bromide.
In Chapter 3, fluorescent probes for the detection of protein phosphorylation on SDS-PAGE are presented. The probes were designed using bis-Zn2+-bis-cyclen as a dinuclear metal-chelate phosphate recognition unit equipped with an environment-sensitive fluorophore. The specificity of the probes is determined by their binding site selectivity towards phosphate ions and the emission wavelength shift induced by the change in the electrostatic environment of the fluorophore upon binding to a phosphorylated amino acid residue. The staining is fully reversible due to the non-covalent binding of the probe. Gel bands with less than 100 µg of phosphorylated alpha-Casein were detectable with these new probes on a normal UV-table without specialized equipment like a laser-based gel scanner or a cooled camera detector.
In Chapter 4, the preparation of Zn2+-cyclen-peptide hybrid compounds and bis-Zn2+-cyclen complexes is described as potential binders of the guanine nucleotide binding protein Ras, an important molecular switch in cellular signal transduction. The design of the compounds is based on the previous observation that Zn2+-cyclen complexes could serve as lead compounds for inhibitors of Ras-effector interaction and thus be able to interrupt Ras induced signal transduction. Zn2+-Cyclen selectively stabilizes conformational state 1 of active Ras, a conformational state with drastically decreased affinity to effector proteins like Raf-kinase. To achieve higher binding affinities of such Ras-Raf interaction inhibitors, Zn2+-cyclen conjugates with short peptides, derived from the sequence of the Ras-activator SOS, were prepared by solid phase synthesis protocols. Dinuclear bis-Zn2+-cyclen complexes were obtained from alkyne-azide cycloaddition reactions. NMR investigations of the prepared compounds revealed that the peptide conjugates do not lead to an increase in Ras binding affinity of the metal complex – peptide conjugates. The dinuclear zinc complexes lead to an immediate precipitation of the protein prohibiting spectroscopic investigations of their binding.
Chapter 5 shows the synthesis of three new cholesterol derivatives with enhanced water-solubility. Water-soluble cholesterol derivatives for studies investigating the role of Cholesterol in mammalian cells under physiological conditions are rare so far. Therefore, efficient syntheses for new cholesterol derivatives with enhanced water-solubility have been developed. Either substitution at C(3)-OH of Cholesterol with ethylene glycols or reductive amination at the keto group of Pregnenolone yielded steroids with significantly increased water-solubility. The solubility of the cholesterol derivatives in water was determined by 1H-NMR spectroscopy in D2O with DSS as reference to be 1 to 6 mg/mL at room temperature. The comparison of resonance signal line width in water and chloroform solution showed little aggregation for compound 4 and 5, while broader resonance signals indicate micelle formation for compound 9.
Translation of the abstract (German)
In Kapitel 1 dieser Arbeit wird die molekulare Unterscheidung von kleinen Biomolekülen mittels Analyt-induzierter Pyren-Excimer-Fluoreszenz gezeigt. Die reversible Koordination von Zn2+-Cyclenen an Phosphatanionen und Imide unter physiologischen Bedingungen ist literaturbekannt. Diese Eigenschaft von Zn2+-Cyclen Komplexen in Kombination mit Pyren als Fluorophor führte im Fall von Thymin- und ...
Translation of the abstract (German)
In Kapitel 1 dieser Arbeit wird die molekulare Unterscheidung von kleinen Biomolekülen mittels Analyt-induzierter Pyren-Excimer-Fluoreszenz gezeigt. Die reversible Koordination von Zn2+-Cyclenen an Phosphatanionen und Imide unter physiologischen Bedingungen ist literaturbekannt. Diese Eigenschaft von Zn2+-Cyclen Komplexen in Kombination mit Pyren als Fluorophor führte im Fall von Thymin- und Uracil-Nukleotiden, zur Bildung ternärer Komplexe, die aus zwei Pyren-tragenden Metall-Komplexen und einem Analytmolekül bestehen. Auch andere Analyten mit zwei entsprechenden Bindungsstellen zeigten dieses Verhalten. Die somit erzwungene räumliche Nähe der beiden Pyren-Einheiten führte schließlich bei Anregung zur Bildung eines Pyren-Excimers, dessen Emission sich deutlich von der eines Pyren-Monomers unterscheidet. Dieser Unterschied war auch mit dem bloßen Auge erkennbar. Durch dieses Prinzip konnten in gepufferter, wässriger Lösung UMP, UDP, UTP und TTP nachgewiesen werden, während andere Nukleotide ohne Imid-Einheit als weitere Bindungsstelle für den Zn2+-Cyclen Komplex keine Excimer-Emission induzierten und lediglich Pyren-Monomer Fluoreszenz zeigten. In gleicher Weise fungierte Zn2+-Cyclen-pyren als Chemosensor für PPi und Fructose-1,6-bis-Phosphat. Im Gegensatz dazu erwies sich der zweikernige Bis-Zn2+-bis-cyclen Komplex als weniger selektiv für Thymin- und Uracil-Nucleotide, da er neben diesen auch in Gegenwart von IDP und ITP ternäre Komplexe bildete. Darüber hinaus wurde bei dieser Verbindung keine induzierte Excimer-Emission mit den Analyten UMP, PPi und Fructose-1,6-bis-Phosphat beobachtet.
Kapitel 2 zeigt eine weitere interessante Eigenschaft des bereits in Kapitel 1 vorgestellten Zn2+-Cyclen-pyren auf – es kann als DNA-Färbereagenz eingesetzt werden. Die reversible Wechselwirkung des Pyren-markierten Metall-Komplexes mit dem Phosphatrückgrat der DNA induzierte bei Anregung im UV-Bereich – ähnlich wie in Kapitel 1 beschrieben – Pyren-Excimer Emission was zu sichtbaren Gelbanden führte. Zwar ist dieses Färbeverfahren auf Agarose-Gele beschränkt und auch die Sensitivität reicht nicht an die von Ethidiumbromid heran, jedoch konnten bis zu 10 ng DNA nachgewiesen sowie auch kurze DNA Stränge sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus wurde durch Gelextraktion der mit Zn2+-Cyclen-pyren angefärbten DNA-Banden und anschließender erneuter Gelelektrophorese gezeigt, dass dieses Färbeverfahren in DNA offensichtlich keine größeren Schäden (z. B. Strangbruch) hervorgerufen hatte. Aus einer abschließenden Cytotoxizitätsstudie auf HeLa- und V-79-Zellen ging hervor, dass Zn2+-Cyclen-pyren verglichen mit Ethidiumbromid wesentlich weniger toxisch ist.
In Kapitel 3 werden Fluoreszenzsonden vorgestellt, die als Färbereagentien in der Lage sind Proteinphosphorylierung nach der Durchführung von SDS-PAGE anzuzeigen. Hierfür wurden zweikernige, an Phosphatgruppen bindende Bis-Zn2+-bis-cyclen Komplexe mit Coumarin und Carboxyfluorescein als umgebungsabhängige Fluorophore synthetisiert. Die Spezifität der Verbindung ist begründet durch die Selektivität der zweikernigen Metall-Komplexer für Phosphat-Gruppen und die durch die Bindungswechselwirkung dieser Metall-Komplexer mit Seitenketten-phosphorylierten Aminsosäuren bewirkte Änderung der elektronischen Struktur des Fluorophors. Diese führt schließlich zur Verschiebung der Emissionsbande. Durch nicht-kovalente Bindungswechselwirkung zwischen Fluoreszenzsonde und Phosphat-Gruppe ist der Färbeprozess reversibel. Somit konnten auf einem gängigen UV-Tisch Gelbanden mit weniger als 100 µg phosphoryliertes alpha-Casein detektiert werden.
Kapitel 4 behandelt die Synthese von Zn2+-Cyclen-Peptid Hybrid-Liganden und zweikernigen Bis-Zn2+-cyclen Komplexen. Diese Verbindungen sollten an das Guanin-Nukleotid bindende Protein Ras binden, um dessen Funktion als wichtiger molekularer Schalter zellulärer Signaltransduktion zu beeinflussen. Da frühere Ergebnisse zeigten, dass Zn2+-Cyclen in der Lage ist gezielt den Effektorprotein schwach bindenden Zustand 1 von Ras zu stabilisieren, wurde Zn2+-Cyclen als Lead-Struktur zur Synthese neuer potentieller Inhibitoren der Ras-Raf Wechselwirkung herangezogen. Um Inhibitoren mit höheren Bindungsaffinitäten zu erhalten, wurden Zn2+-Cyclen-Peptid Konjugate mittels Festphasenpeptidsynthese dargestellt, deren Peptid-Sequenz vom Ras-aktivierenden Protein SOS abgeleitet wurden. Darüber hinaus wurden auch zweikernige Bis-Zn2+-cyclen Komplexe mittels 1,3-dipolarer Alkin-Azid Cycloaddition synthetisiert. NMR-Spektroskopische Untersuchungen zeigten jedoch, dass die Zn2+-Cyclen-Peptid Konjugate keine verstärkte Bindungswechselwirkung mit Ras aufweisen. Die Bindungseigenschaften der zweikernigen Zink Komplexe konnten hingegen nicht mittels NMR-Techniken untersucht werden, da deren Zugabe zur Protein-Lösung eine Fällungsreaktion zur Folge hatte.
Kapitel 5 zeigt die Synthese von neuen Cholesterinderivaten mit erhöhter Wasserlöslichkeit. Bislang existieren kaum wasserlösliche Cholesterinderivate an Hand derer man die Rolle, die Cholesterin in Säugerzellen spielt unter physiologischen Bedingungen genauer untersuchen könnte. Aus diesem Grund wurden effiziente Synthesen zur Herstellung solcher Cholesterine entwickelt. So wurden Steroide mit gesteigerter Wasserlöslichkeit erhalten indem man entweder die C(3)-OH Gruppe des Cholesterins mit Ethylenglykolen substituierte oder unter Verwendung von Ethylenglykolaminen eine reduktive Aminierung an der Keto-Funktion von Pregnenolon durchführte. Mittels 1H-NMR Spektren der erhaltenen Verbindungen in D2O mit DSS als Referenz konnte schließlich die Wasserlöslichkeit bestimmt werden (1-6 mg/mL bei Raumtemperatur). Aus den Spektren erkennbare Unterschiede der Linienbreiten wiesen des Weiteren darauf hin, dass Substanzen 4 und 5 nur sehr geringen Tendenz zur Aggregation aufweisen. Für Verbindung 9 hingegen wurde eine deutliche Verbreiterung der Resonanz-linien festgestellt, die auf Mizellenbildung zurückzuführen sein könnte.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 08:55
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