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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-156997
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.15699
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
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Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 16 Juli 2010 |
Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Dr. Gerhard Rogler und PD Dr. Frauke Bataille |
Tag der Prüfung: | 24 Juni 2010 |
Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Innere Medizin I |
Stichwörter / Keywords: | Fibroblast, Fibrose, PGE2, Migration, CED, fibroblast, fibrosis, PGE2, migration, Crohn’s disease |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 15699 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) sind eine multifaktoriell bedingte Störung, die durch chronischen Schaden der intestinalen Epithelzellschicht und des tiefer liegenden Bindegewebes charakterisiert ist. Die Ätiologie der chronisch entzündlichen Darmkrankheiten Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa ist vielschichtig und bisher noch weitgehend unbekannt. Die Migration und die ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) sind eine multifaktoriell bedingte Störung, die durch chronischen Schaden der intestinalen Epithelzellschicht und des tiefer liegenden Bindegewebes charakterisiert ist. Die Ätiologie der chronisch entzündlichen Darmkrankheiten Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa ist vielschichtig und bisher noch weitgehend unbekannt. Die Migration und die Proliferation von Colon Lamina Propria Fibroblasten (CLPF) sowie deren Produktion von extrazellulärer Matrix spielen bei der Wundheilung im Verlauf der Entzündung und bei der Fistel- und Strikturentstehung eine entscheidende Rolle. Eine spezifische medikamentöse Therapie ist weder für CED noch für deren Komplikationen bekannt. Deswegen sind neue Therapiemöglichkeiten zur medikamentösen Prävention oder zur Behandlung von Komplikationen wie Fisteln oder Stenosen und zur Verbesserung der postoperativen Wundheilung bei CED dringend notwendig. Dazu müssen die Mechanismen, die bei der Wundheilung eine Rolle spielen, untersucht und verstanden werden. Aus Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe ist bekannt, dass die CLPF aus der gesunden Darmmukosa und die CLPF von Patienten mit Morbus Crohn unterschiedlich stark migrieren. CLPF, die aus entzündlicher Darmmukosa von Morbus Crohn-Patienten stammten, migrierten weniger als CLPF, die aus der gesunden Darmmukosa von Kontrollpatienten isoliert wurden. Möglicherweise wird die Migration von CLPF durch verschiedene Faktoren moduliert, die während der Wundheilungs- und Entzündungsprozesse von intestinalen Fibroblasten, Myofibroblasten und anderen Zellen verstärkt sezerniert werden können. Bei den Entzündungsprozessen der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen spielt die Arachidonsäure als Vorläuferin von Prostanoiden und Eicosanoiden, unter denen besonders Prostaglandin E2, eine wichtige Rolle.
In dieser Arbeit wurden primär intestinale CLPF von Kontroll-Patienten isoliert, kultiviert und immunhistochemisch charakterisiert. Anschließend wurden Migrations-Assays in der modifizierten 48-Boyden-Kammer durchgeführt, um das Migrationsverhalten der Darmfibroblasten zu untersuchen.
Um den Einfluss der Extrazellulärmatrix-Komponenten, wie z.B. Fibronektin und des Gewebehormons Prostaglandin E2 auf intestinale CLPF zu untersuchen, wurden Migrations-Assays mit steigernder Konzentration von Fibronektin und PGE2 durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Migration von CLPF mit steigender Fibronektin-Konzentration zunimmt. Im Gegensatz dazu wurde die Migration von CLPF mit zunehmender PGE2-Konzentration signifikant und dosisabhängig reduziert.
Die Checkerboard-Analyse zeigte, dass Fibronektin sowohl die Chemotaxis (gerichtete Migration), als auch die Chemokinese induzierte. Es konnte bei der Checkerboard-Analyse nach einer Zugabe von PGE2 eine dosisabhängige Hemmung, sowohl der Chemotaxis als auch der Chemokinese beobachtet werden.
Durch weitere Migrations-Assays wurde der genaue Wirkungsmechanismus von PGE2 auf die CLPF untersucht. Die Versuche zeigten, dass PGE2 über die spezifischen membrangebundenen G-Protein Rezeptoren - EP2 und EP4 - die Migration von intestinalen CLPF signifikant reduziert. Diese Hemmung des Migrationspotentials konnte durch die Blockierung von EP2- und EP4-Subtyp Rezeptoren aufgehoben werden. Die Signaltransduktion von PGE2 über die EP2- und EP4-Rezeptoren führt durch die Aktivierung der Adenylatcyclase zu einem Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration. Danach wurde die intrazelluläre cAMP-Konzentration quantitativ mittels ELISA gemessen. Nach einer vorherigen Inkubation der Zellen mit PGE2 konnte eine signifikante Steigerung des intrazellulären cAMP-Niveaus bestätigt werden. Hingegen wurde nach einer Vorinkubation der CLPF mit EP2- und EP4-Rezeptor-Antagonisten, trotz des PGE2-Einflusses, eine minimale Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration gemessen. Das bestätigte noch einmal die Signaltransduktion von PGE2 auf die CLPF durch den Anstieg des intrazellulären cAMP.
Des Weiteren wurde die cAMP-Wirkung auf die CLPF weiter untersucht. In Migrations-Assays mit steigender Konzentration des direkten Stimulators der Adenylatcyclase Forskolin, konnte eine dosisabhängige signifikante Hemmung der Migration von CLPF, bedingt durch den intrazellulären cAMP-Anstieg, beobachtet werden. Auch die beiden getesteten Phosphodiesterase-Hemmer Pentoxyphyllin und Rolipram zeigten eine konzentrationsabhängige Reduktion der Migration von CLPF, diese wurde durch eine Zugabe von PGE2 noch stärker gehemmt, ebenfalls durch die Steigerung des cAMP-Niveaus.
Als letztes wurde mittels ELISA eine quantitative Messung der PGE2- Konzentration in Zellüberständen von Kontroll-CLPF, die aus dem gesunden Milieu des Darmes stammen, sowie von CLPF, die vorher einem „inflammatorischen Milieu“ ausgesetzt waren, durchgeführt. Als Ergebnis wurde nach einer Aktivierung der CLPF durch vorherige Stimulation mit den Zytokinen - IL-1ß und IFN-gamma - ein signifikanter PGE2-Konzentrationsanstieg - im Vergleich zu Kontroll- CLPF - in den Zellüberständen gemessen.
In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, neue Mechanismen und Faktoren aufzudecken, die die Migration von intestinalen CLPF beeinflussen. Das Migrationsverhalten von CLPF korrelierte mit der Fibronektinkonzentration. PGE2 führte über die spezifischen membrangebundenen G-Protein Rezeptoren - EP2 und EP4 - zu einem Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration, welche das Migrationspotential von intestinalen CLPF signifikant reduziert. CLPF, die aus dem „inflammatorischen Milieu“ stammten, zeigten eine signifikant erhöhte PGE2-Sekretion.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Background: Migration of colonic lamina propria fibroblasts (CLPF) is an important mechanism during wound healing in inflammatory bowel disease (IBD). The concentration of prostaglandin E2 (PGE2) is increased in the intestinal mucosa of IBD patients. This study therefore investigated the role of PGE2 in CLPF migration. Methods: Primary cultures of CLPF were isolated from healthy controls and ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Background: Migration of colonic lamina propria fibroblasts (CLPF) is an important mechanism during wound healing in inflammatory bowel disease (IBD). The concentration of prostaglandin E2 (PGE2) is increased in the intestinal mucosa of IBD patients. This study therefore investigated the role of PGE2 in CLPF migration.
Methods: Primary cultures of CLPF were isolated from healthy controls and Crohn’s disease patients. Migration assays were performed in the Boyden chamber and scratch assays. EP receptors, PGE2, intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP), were determined by immunoblotting, immunocytochemistry, wound healing cell migration assay and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Results: All four EP receptor subtypes were present on CLPF. PGE2 and agonists to the EP2 and EP4 receptor reduced the migration of CLPF. Blockade of the EP2 and the EP4 receptor inhibited the effect of PGE2 on CLPF migration. An increase in intracellular cAMP reduced CLPF migration. PGE2 increased the concentrations of cAMP in CLPF, with abrogation after addition of EP2 and EP4 receptor antagonists.
Conclusions: PGE2 reduced the migration of CLPF. This effect appears to be mediated by the EP2 and EP4 receptors and cAMP elevation. PGE2 could contribute to the modulation of profibrotic responses and therefore play an important role in controlling fibrogenesis or inducing insufficient wound healing. Therefore, it is possible that PGE2-mediated pathways could be a therapeutic target to augment impaired healing or to block the development of excessive fibrosis.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 08:50