Identification of the biotin transporter in Escherichia coli, biotinylation of histones in Saccharomyces cerevisiae and analysis of biotin sensing in Saccharomyces cerevisiae

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-158226
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.15822

Ringlstetter, Stefan Ludwig

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Date of publication of this fulltext: 04 May 2011 09:01

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	4 May 2011
Referee:	PD Dr. Jürgen Stolz and Prof. Dr. Ludwig Lehle and Prof. Dr. Reinhard Sterner
Date of exam:	29 April 2010
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Klaus Grasser)
Interdisciplinary Subject Network:	Not selected
Keywords:	Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, biotin transport, vitamin, biotin sensing, membrane transport, gene regulation, biotin, transport mechanism, histone
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	15822

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Abstract (English)

Abstract (English)

Biotin transport in E. coli was already observed in 1972. Results in this work demonstrate yigM is the gene encoding the E. coli biotin transporter. The protein has 10 predicited transmembrane domains and shows homology to members of the subfamiliy of carboxylate/amino acid/amine transporters. Deletion of yigM led to complete loss, overexpression with different expression systems to a dose dependent increase of biotin uptake. The function of YigM was shown in whole cells and in reconstituted membrane vesicles. Weak inhibition of biotin uptake by protonophores, the respiratory chain blocker NaN3, as well as uptake in not energized membrane vesicles suggest biotin uptake by a facilitated diffusion mechanism.
E. coli cells overexpressing YigM displayed saturable biotin uptake kinetics (KM of 74 ± 14 nM). This value is similar to previously reported measurements in wt cells, indicating that YigM is the only biotin transporter in E. coli. The set of plasmamembrane biotin transporters is extended by yigM, as transporters for mammals, eucaryotic unicellular organisms, gram-positive bacteria and archea have already been described before. Biotin dependent regulation of the yigM-gene was shown by experiments with a luciferase-reporter construct.
In S. cerevisiae evidence for a role of biotin dependent pyruvate carboxylases, especially pyruvate carboxylase 2 in biotin sensing was provided. Single-knockouts of the two PYC genes reduce the response to low biotin concentrations, as shown by GFP-reporter-assays and western-blot. A double-knockout mutant for both pyruvate carboxylase genes even suppresses low biotin signals completely. The role of Pyc2p in biotin sensing was demonstrated to be independent of changes in expression, biotinylation and enzymatic activity. However experiments with fusing an epitope tag and truncation of the protein at the C-terminus revealed this end of the protein seems to influence sensing.
Additionally in vivo biotinylation of S. cerevisiae histones H2B, H3 and H4 was demonstrated. A possible role of biotinylated histones in biotin sensing is discussed.

Translation of the abstract (German)

Biotin Aufnahme in E. coli konnte bereits 1972 gezeigt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das Gen yigM den E. coli Biotin-Transporter kodiert. Das Protein weist 10 vorhergesagte Transmebrandomänen auf und zeigt Homologie zu Mitgliedern der Unterfamilie der Carboxylat/ Aminosäure/ Amin-Transporter. Eine Deletion von yigM führt zum vollständigen Verlust, eine Überexpression mit verschiedenen Expressionssystemen zu einer Dosis-abhängigen Steigerung der Biotin-Aufnahme. Die Funktion von YigM wurde sowohl in intakten Zellen, als auch in rekonstituierten Membranvesikeln gezeigt. Nur geringe Abschwächung der Biotin-Aufnahme durch Protonophoren, den Atmungsketten-Hemmer Natriumazid, sowie Aufnahme in nicht energetisierten Membranvesikeln legen eine Biotin-Aufnahme durch erleichterte Diffusion nahe.
E. coli Zellen mit überexprimiertem YigM zeigen eine sättigbare Aufnahmekinetik mit einem KM-Wert von 74 ± 14 nM. Dieser Wert stimmt gut mit zuvor publizierten Ergebnissen, die Messungen in Wildtyp-Zellen ergaben überein. Dies zeigt, dass YigM die bereits bekannte Biotin-Aufnahme ermöglicht und der einzige Biotin-Transporter in E. coli ist. Die Liste der bisher bekannten Biotin Transporter wird durch yigM ergänzt, da bereits Transportsysteme im Säugern, einzelligen Eukaryoten und in gram-positiven Bakterien und Archaeen beschrieben wurden. Biotin-abhängige Regulation des yigM-Gens konnte mit Hilfe von Luciferase-Reporter-Ansätzen gezeigt werden.

In S. cerevisiae konnten Hinweise auf eine Rolle der Pyruvat-Carboxylasen, speziell der Pyruvat-Carboxylase 2 auf die Biotin-Wahrnehmung gefunden werden. Die Deletion der jeweils eines der beiden PYC-Gene resultierte in einer verminderten Antwort auf niedrige Biotin-Konzentrationen, wie durch GFP-Reporter-Ansätze und Western-blot-Analysen gezeigt werden konnte. Eine Doppelmutante für beide PYC-Gene zeigte vollständige Suppression der Reaktion auf niedrige Biotin-Konzentrationen. Es konnte gezeigt werden, dass die Rolle von Pyc2p in der Biotin-Wahrnehmung unabhängig vom eigenen Expressionsgrad, der enzymatischen Aktivität und der Biotinylierung war. Versuche in denen Epitope an den C-Terminus des Proteins fusioniert wurden, bzw. dieses Ende des Proteins verkürzt wurde, zeigten einen Einfluss dieses Terminus des Proteins auf die Biotin-Wahrnehmung.
Weiterhin konnte in vivo Biotinylierung der S. cerevisiae Histon-Proteine H2B, H3 und H4 mit Hilfe von Western-blot-Analysen gezeigt werden. Eine mögliche Rolle biotinylierter Histone auf die Biotin-Wahrnehmung der Zellen wird diskutiert.

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