| License: Publishing license for publications excluding print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-195819
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.19581
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 February 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Rüdiger Schmitt and Prof. Dr. Bernhard Weber |
| Date of exam: | 9 February 2011 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Dimerisierung, dimerisation, Oligomerisierung, oligomerisation, Bestophin, VMD2, Morbus Best, Best Disease, AVMD, ADVIRC, ARB, AMD, Kanal, Channel, Chloridkanal, choride channel, RPE, Retina, Auge, eye |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 19581 |
Abstract (German)
Vitteliforme Makuladystrophie Typ 2 (VMD2; OMIM #153700) ist eine autosomal dominante Erkrankung, die durch Mutationen im VMD2-Gen verursacht wird. Charakteristische Krankheitsmerkmale sind Eidotter-ähnliche Läsionen im Bereich der Makula, die eine Atrophie des retinalen Pigmentepithels (RPE) sowie der Netzhaut bedingen und im progredienten Krankheitsverlauf zum zentralen Visusverlust führen ...
Abstract (German)
Vitteliforme Makuladystrophie Typ 2 (VMD2; OMIM #153700) ist eine autosomal dominante Erkrankung, die durch Mutationen im VMD2-Gen verursacht wird. Charakteristische Krankheitsmerkmale sind Eidotter-ähnliche Läsionen im Bereich der Makula, die eine Atrophie des retinalen Pigmentepithels (RPE) sowie der Netzhaut bedingen und im progredienten Krankheitsverlauf zum zentralen Visusverlust führen können. Das Genprodukt von VMD2, das Bestrophin-1-Protein, wird überwiegend im RPE exprimiert und definiert mit den paralogen Bestrophinen 2-4 die humane Bestrophinfamilie. Das integrale
Membranprotein Bestrophin-1 fungiert wahrscheinlich als Ca2+-abhängiger Chloridkanal oder als ein Regulator der Ca2+-Homöostase in RPE-Zellen. VMD2-Mutationen sind außerdem noch mit drei weiteren seltenen erblichen Augenerkrankungen assoziiert, der Adulten Vitteliformen Makuladystrophie (AVMD; OMIM #608161), der Autosomal Rezessiven Bestrophinopathie (ARB; OMIM #611809) und der Autosomal Dominanten
Vitreoretinochoroidopathie (ADVIRC; OMIM #193220). Bei ADVIRC zeigt sich abweichend von den anderen Erkrankungen als klinisches Bild unter anderem Nanophtalmos, was über
eine zusätzliche Funktion von Bestrophin-1 in der okulären Entwicklung spekulieren lässt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der molekularen Wirkungsweise von
Bestrophin-1 genauer charakterisiert, um die pathologischen Mechanismen von VMD2-assoziierten Erkrankungen besser verstehen zu können. Zu diesem Zweck wurden in-silico-,
in-vitro- und in-vivo-Analysen zur Protein-Dimerisierung, der Expression und dem RNA-Spleißen durchgeführt.
Mit Hilfe eines ToxR-basierten Dimerisierungsassays und eines MalE-basierten Membranintegrationsassays wurden die 6 putativen TMD der Bestrophine 1-4 bezüglich ihrer
Dimerisierungseigenschaft und Membranintegration in einem biologischen Membransystem untersucht. Hierbei konnte bei allen Bestrophinen in drei von sechs TMD-Regionen
Dimerisierung nachgewiesen werden. Bis auf eine leichte Abweichung bei Bestrophin-1 findet sich innerhalb der Bestrophin-Proteinfamilie ein einheitliches Dimerisierungmuster der beteiligten TMD. Zusätzlich wiesen 6 der 28 untersuchten Bestrophin-1-Mutationen ein signifikant verändertes Dimerisierungsverhalten im Vergleich zu den wildtypischen TMDen auf. Die ergänzenden Membranintegrationanalysen zeigten ein einheitliches Muster bei Bestrophin-1-4 und unterstützen somit das postulierte Topologiemodell, bei dem vier von sechs TMD membrandurchspannend sind. Mit einem unabhängigen Versuchsansatz wurde die Bestrophin-1-TMD-Dimerisierung mit rekombinant exprimierten Fusionsproteinen in
einem in-vitro-Detergenzien-Mizellen-Dimerisierungsassay analysiert. Auch hier konnte für Bestrophin 1, für TMD1 und TMD5 Homodimerisierung nachgewiesen werden. Zwei von
neun analysierten pathologischen Mutationen zeigten in vitro abweichende Dimerisungseigenschaften. Die partielle Divergenz zwischen in-vivo- und in-vitro-Befunden kann durch die unterschiedlichen Eigenschaften von Detergenzien und biologischen Membranen erklärt werden; ein Effekt, der bereits bei der Analyse anderer Proteine beobachtet werden konnte.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass mit zwei unabhängigen Versuchsansätzen ein Dimeriserungspotential der TMD der Bestrophinproteinfamilie nachgewiesen werden konnte.
Für einen kleinen Teil der bekannten humanen Mutationen stellen veränderte Dimerisierungseigenschaften einen möglichen Pathomechanismus dar. In weitergehenden Analysen konnte ein neues proximales, sehr starkes VMD2 Promotorelement identifiziert und charakterisiert werden. SNPs in diesem Bereich können die VMD2-Promotoraktivität beeinflussen und bieten eine mögliche Erklärung für die starke Variabilität in der Penetranz und im Phänotyp bei VMD2-Patienten. Zusätzlich wurden Hinweise für eine zirkadiane Regulierung des VMD2 Promotors gefunden. Weitere pathologische VMD2-Mutationen konnten mit der Bildung von alternativen Transkripten durch Spleiß-Variation korreliert werden, die jetzt zusammen mit den klinischen Daten als Genotyp-Phänotyp-Korrelationen bei ADVIRC zu diskutieren sind. Auch wenn durch diese Arbeit die genaue Funktion von Bestrophin nicht vollständig aufgeklärt wurde, konnten vielfältige neue Ansatzpunkte für weiterführende Untersuchungen erarbeitet werden, wobei insbesondere ausgewählten Tiermodellen zukünftig eine wesentliche Rolle zukommen sollte.
Translation of the abstract (English)
Best Vitelliform Macular Dystrophy (VMD2; OMIM #153700) is an autosomal dominant disease, caused by mutations in the VMD2 gene. Disease hallmarks are egg yolk-like deposits in the macular area and an atrophy of the retinal pigment epithelium (RPE) and retina. These traits are linked to a progressive course of the disease, ultimately leading to loss of central vision. VMD2 encodes Bestrophin-1, ...
Translation of the abstract (English)
Best Vitelliform Macular Dystrophy (VMD2; OMIM #153700) is an autosomal dominant disease, caused by mutations in the VMD2 gene. Disease hallmarks are egg yolk-like deposits
in the macular area and an atrophy of the retinal pigment epithelium (RPE) and retina. These traits are linked to a progressive course of the disease, ultimately leading to loss of central vision. VMD2 encodes Bestrophin-1, which is predominantly expressed in RPE cells. Bestrophin-1 together with its paralogues Bestrophin-2-4 defines the human Bestrophin protein family. Bestrophin-1 as an integral membrane protein possibly functions as Ca2+- dependent chloride channel or as a regulator of Ca2+ homeostasis in RPE cells. VMD2 mutations are linked to three additional rare genetic eye diseases. Adult-onset Vitelliform Macular Dystrophy (AVMD; OMIM #608161), Autosomal Recessive Bestrophinopathy
(ARB; OMIM #611809) and Autosomal Dominant Vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC; OMIM #193220). ADVIRC presents with the diagnosis of nanophthalmos, a distinguished
clinical feature when compared to the other bestrophinopathies, indicating an additional developmental functional aspect of Bestrophin-1. In this thesis, several lines of experiments were pursued to elucidate the molecular mode of action of Bestrophin-1 and the pathologic mechanisms of VMD2-associated mutations. To this end, in silico, in vitro and in vivo experiments assessing protein dimerisation, gene
expression and RNA splicing were conducted. Using a ToxR-based dimerization assay and a MalE-based membrane integration assay, all six transmembrane domains (TMDs) of each one of the Bestrophins 1 to 4 were investigated in a biological membrane system regarding their dimerization and membrane integration capabilities. In the Bestrophins, three out of six possible TMDs showed dimerization. Beside a minor difference in Bestrophin-1, a similar pattern was detected for all members of the human Bestrophin family. In addition, 6 out of 28 Bestrophin-1 mutations exhibited significant alterations in their dimerization characteristics compared to corresponding nonmutated TMDs. Supplemental membrane integration analysis
showed a consistent pattern of integrating TMDs, highly supporting the topology model with 4 membrane spanning TMDs for the human Bestrophin protein family. In an alternative
approach the dimerization properties of the six Bestrophin-1 TMDs were determined by analyzing the recombinantly expressed fusion proteins in an in vitro detergent micelles assay.
Dimerization of Bestrophin-1 was likewise demonstrated by through TMD1 and TMD5. Within these TMDs two mutations out of nine revealed distinguished dimerization properties.
The partial divergence between the results of the in vivo and in vitro analysis could be easily explained by the varying properties of detergents and biological membranes, as seen before while analysing other proteins. In summary, dimerization of members of the Bestrophin family TMDs has been shown by
two independent experimental approaches. Altered dimerization properties caused by patient related mutations could be a pathological mechanism for a small number of mutations.
In additional experiments, a new, strong VMD2 promotor element was identified and characterized. SNPs in this genomic region can influence the VMD2 promotor activity and may be responsible for the distinct variability in penetrance and in phenotypes of VMD2 patients. Furthermore, hints on a circadian regulation of the VMD2 promotor were found. Additional pathological VMD2 mutations were correlated with the generation of alternative splicing products, which might be discussed together with the clinical data regarding their
genotype-phenotype associations in ADVIRC and Best’s disease.
Although the function of Bestrophin-1 could not be fully unravelled during the course of this thesis, several novel lines of thoughts for future investigations were given. Especially animal model systems will most likely play an important role in the future.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 07:34
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