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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-218664
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.21866
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
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Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 26 August 2011 |
Begutachter (Erstgutachter): | PD Dr. Thomas Weiß |
Tag der Prüfung: | 4 August 2011 |
Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Chirurgie |
Stichwörter / Keywords: | HCC, ALR, Immunhistochemie |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 21866 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Hintergrund: Das Protein ALR (Augmenter of Liver Regeneration) gilt als ein wichtiger Faktor im Prozess der Leberregeneration und wurde ursprünglich als Homogenat aus sich regenerierenden Rattenlebern gewonnen. ALR wird in allen Zellen des menschlichen Körpers exprimiert, in großen Mengen findet es sich aber in der Leber und im Hoden. Bisher konnte gezeigt werden, dass in zirrhotischem ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Hintergrund:
Das Protein ALR (Augmenter of Liver Regeneration) gilt als ein wichtiger Faktor im Prozess der Leberregeneration und wurde ursprünglich als Homogenat aus sich regenerierenden Rattenlebern gewonnen. ALR wird in allen Zellen des menschlichen Körpers exprimiert, in großen Mengen findet es sich aber in der Leber und im Hoden. Bisher konnte gezeigt werden, dass in zirrhotischem Lebergewebe mehr ALR exprimiert ist als in gesundem Lebergewebe. Zusätzlich konnte eine erhöhte ALR-Expression auch im HCC nachgewiesen werden. Das Ziel dieser Arbeit bestand zum einen darin die Expression von ALR im HCC an einer höheren Fallzahl zu untersuchen und mit der Expression in gesundem Lebergewebe und in der Zirrhose zu vergleichen. Zum anderen wurde die Expression von ALR im HCC mit histomorphologischen, laborchemischen, klinischen Daten und Überlebensdaten korreliert.
Material und Methoden:
Material: Die Untersuchung der ALR-Expression erfolgte mittels Immunhistochemie. Als Material stand ein Tissue-micro-array (TMA) mit 233 Proben von HCCs, 163 Proben von Leberzirrhosen und 18 normalem Lebergewebeproben zur Verfügung. Außerdem konnten Paraffinblöcke von 53 HCCs, 28 Zirrhosen und 24 Normalgeweben genutzt werden, die mit Hilfe der Gewebedatenbank der Stiftung HTCR (Human Tissue and Cell Research) ausgewählt wurden. Zu allen diesen Gewebeproben existierte eine Datenbank mit klinischen Daten.
Immunhistochemische Analyse der ALR-Expression: Die Immunhistochemie wurde mit einem DAKO Envision System mit einem polyklonalen Antikörper gegen humanes ALR aus dem Kaninchen (0,16 mg/ml) durchgeführt. Im Detail wurden von den Paraffinblöcken Schnitte von 2 μm Dicke angefertigt und diese auf Objektträger aufgezogen, der TMA war bereits auf einem Objektträger aufgezogen. Zunächst wurden die Schnitte und der TMA entparaffiniert und mittels einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert. Danach erfolgte eine Antigendemaskierung mit Proteinase K. Anschließend erfolgte das Auftragen eines 3-prozentigen humanen Serums. Nun wurde der Primärantikörper gegen humanes ALR aus dem Kaninchen (Verdünnung 1:600) auf die Schnitte und den TMA aufgetragen und bei 4°C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Schnitte und der TMA mit PBS gewaschen und anschließend als sekundärer Antikörper ein Maus-anti-Kaninchenantikörper aufgetragen. Nach 1 Stunde Inkubationszeit wurde der Sekundärantikörper erneut mit PBS abgewaschen. Nun wurde ein Ig-Maus-Antikörper aus dem Kaninchen auf die Proben aufpipettiert und nach einer einstündigen Inkubation erneut mit PBS abgewaschen. Als nächster Schritt wurde der APPAP-Komplex aus der Maus auf die Schnitte und den TMA aufgetragen und für 30min inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS wurde die Färbung durch das Inkubieren der Proben mit Fast Red Chromogen für 20min vervollständigt. Zuletzt wurden die Schnitte mit Hämatoxylin zur Kernfärbung gegengefärbt. Die Negativkontrollen wurden an den Proben mit einem Kaninchenantikörper anstelle des Primärantikörpers gegen ARL durchgeführt.
Auswertung des Färbeergebnisses der Immunhistochemie: Die Auswertung des immunhistochemischen Färbeergebnisses der Schnitte und des TMA erfolgte durch einen Pathologen. Als positiv wurde die Proben beurteilt, wenn eine rote zytoplasmatische Färbung der Zellen vorlag. Die Anzahl der positiven Zellen wurde in Prozent angegeben und in 5 Gruppen eingeteilt: 0, <10%; 1 ,10-25%; 2, >25-50%; 3, >50-75%; 4, >75%. Die Intensität der Färbung wurde in 4 Gruppen eingeteilt: 0, negativ; 1, schwach positiv; 2, mäßig positiv; 3, stark positiv. Anschließend wurde ein Gewebe-Label-Index gebildet, indem die Werte der Intensität und Anzahl der positiven Zellen multipliziert und in 3 Gruppen eingeteilt wurden: 0, negativ; 1-5, positiv; 6-12, stark positiv.
Ergebnisse:
In den durchgeführten Negativkontrollen zeigte sich keine rote Anfärbung, so dass die rote Färbung als spezifisch für die ALR-Expression angesehen werden konnte. ALR konnte durch die immunhistochemische Färbung im Zytoplasma von Hepatozyten im normalen und zirrhotischem Lebergewebe und in den Zellen des HCC in Form von roten Granula nachgewiesen werden. Positiv für ALR zeigten sich auch Gallengangszellen in den Portalfeldern, während sich in nichtparenchymalen Leberzellen keine Färbung zeigte.
Eine statistische Auswertung des Arrays erfolgte nicht, da sehr viele der sich darauf befindenden Proben nicht ausgewertet werden konnten, da kein Leberparenchym vorhanden war oder dies nicht vital war und zudem die klinischen Daten sehr unvollständig waren. Bei der Auswertung der Gewebeschnitte mittels des Gewebe-Label-Index konnte gezeigt werden, dass signifikant (p<0,0001) mehr ALR im HCC und in der Zirrhose vorhanden ist als im normalen Lebergewebe. Weiterhin zeigte sich, dass in hepatozellulären Karzinomen, bei denen eine Angioinvasion vorlag, signifikant weniger (p<0,001) ALR nachweisbar war, als in jenen, die nicht gefäßinvasiv waren. Bei der Auswertung des Gradings der HCCs zeigte sich, dass mit steigendem Grading und damit zunehmender Entdifferenzierung der Zellen signifikant (p=0,013) weniger ALR in den Tumorzellen nachweisbar war. Keine signifikanten Ergebnisse ergaben sich in der Auswertung der übrigen histomorphologischen und der laborchemischen und klinischen Daten sowie der Überlebensdaten.
Schlussfolgerung:
In dieser Arbeit konnte an einer größeren Fallzahl erneut gezeigt werden, dass ALR sowohl in der gesunden Leber als auch in der zirrhotischen Leber und im HCC exprimiert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass im Vergleich zur gesunden Leber in der Zirrhose und im HCC signifikant mehr ALR immunhistochemisch nachweisbar ist. Der zudem in dieser Arbeit gefundene Zusammenhang einer negativen Korrelation der Angioinvasion und des Gradings mit der ALR-Expression könnte darauf hinweisen, dass das Protein ALR eine Rolle beim Prozess der Metastasierung spielen könnte und einen Marker für eine schlechtere Prognose darstellen könnte. Diesen Zusammenhang gilt es zukünftig auf DNA-Ebene und Zellebene zu bestätigen.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Background: The protein ALR (augmenter of liver regeneration) is considered to be an important factor in the process of liver regeneration and was originally isolated from a homogenate from regenerating rat livers. ALR is expressed in all cells of the human body, but in large amounts it is found in the liver and testes. So far it was shown that more ALR is expressed in cirrhotic liver tissue than ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Background:
The protein ALR (augmenter of liver regeneration) is considered to be an important factor in the process of liver regeneration and was originally isolated from a homogenate from regenerating rat livers. ALR is expressed in all cells of the human body, but in large amounts it is found in the liver and testes. So far it was shown that more ALR is expressed in cirrhotic liver tissue than in healthy liver tissue. In addition, an increased ALR-expression could also be detected in HCCs. The aim of this work was to investigate the expression of ALR in the HCC in a large number of cases and to compare it with the expression of ALR in healthy and cirrhotic liver tissues. Furthermore the expression of ALR in the HCCs was correlated with histomorphological, clinical and survival data and laboratory values.
Materials and methods:
Material: The study of ALR-expression was performed by immunohistochemistry on a tissue micro-array (TMA) with 233 samples of HCCs and 163 samples of cirrhotic and 18 of normal liver tissue. Paraffin blocks with 53 HCC, 28 cirrhosis and 24 normal liver tissue samples which were selected with the help of the tissue bank of the foundation HTCR (Human Tissue and Cell Research) could be used as well. Clinical data existed to all these tissue samples.
Immunohistochemical analysis of ALR-expression: Immunohistochemistry was performed with a DAKO Envision system using anti-rhALR polyclonal rabbit antibody (0.16 mg/ml). In detail, 2 μm sections were cut from the paraffin-embedded tissues and transferred to silanized glass slides. The TMA already existed on a glass slide. At first the slides and the TMA were deparaffinized in xylene and rehydrated through graded ethanol to distilled water. Afterwards the slides and the TMA were incubated with Proteinase K to unmask the antigens. Then they were placed into PBS buffer containing 3% human serum. In the next step primary anti-rhALR antibody (1:600) was pipetted onto the slides and the TMA and was incubated overnight at 4ºC. After washing with PBS the next day mouse anti-rabbit antibody was added to the slides and the TMA. They were incubated for 1h and washed with PBS again. After that an Ig-mouse antibody from a rabbit was pipetted onto the slides and the TMA, incubated for 1h and washed with PBS. Afterwards APPAP-mouse was added to the samples and incubated for 30 min. After being washed with PBS, staining was completed by an incubation of Fast Red Chromogen lasting 20min. Finally, counterstaining was performed with haematoxylin.
Negative controls were performed by using rabbit isotype IgG instead of anti-rhALR antibody.
Evaluation of the staining results of immunohistochemistry: The immunohistochemically treated samples were analysed by a pathologist. Cell reaction was counted as positive if the cells contained red granules in their cytoplasm. The extent of positive cells was classified in 5 groups: 0: <10%; 1: 10-25%; 2: >25-50%; 3: >50-75%; 4: >75% of the hepatocytes. The intensity of staining was classified into 4 groups: 0, negative; 1, weak; 2, moderate; 3, strong positive. Furthermore a tissue-label-index was generated by multiplying the scores of the extent of positive cells and of the intensity of staining and classifying them into 3 groups: 0, negative; 1 to 5, positive; 6 to 12 strong positive.
Results:
The negative controls showed no red staining so that the red staining could be considered to be specific for the ALR-expression. ALR could be detected by immunohistochemical staining in the form of red granules in the cytoplasm of hepatocytes in normal and cirrhotic liver tissue and in the cytoplasm of the HCC cells. Also positive for ALR were bile duct cells in the portal fields, whereas no staining was detected in nonparenchymal liver cells. The data gathered from analysing the TMA was not sufficient for statistical interpretation, because many of the samples could not be analysed due to the fact that liver parenchyma was not present or cells were not vital and clinical data were incomplete.
The evaluation of the tissue slides by using the tissue-label-index showed that significant (p <0.0001) more ALR is present in HCC and cirrhosis than in normal liver tissue. Furthermore, it was found that in hepatocellular carcinomas without angioinvasion significantly less (p <0.001) ALR was detectable than in those that were not angioinvasive. The evaluation of the grading of the HCCs revealed that with increasing grading and thereby increasing dedifferentiation of the cells significantly (p = 0.013) less ALR was detectable in the tumor cells. No significant results were obtained through the evaluation of other histomorphological clinical and survival data and laboratory values.
Conclusion
In this work it was shown on a large number of cases that ALR is expressed in the healthy and in the cirrhotic liver and in the HCC. In addition, it was found that in cirrhosis and HCCs significantly more ALR is immunohistochemically detectable than in healthy livers. The link between a negative correlation of the grading and angioinvasion with the ALR-expression found in this study may indicate that the ALR protein could play a role in the process of metastasis and may be a marker for poorer prognosis. As a next step this correlation should be confirmed at DNA and cell levels
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 06:11