| License: Publishing license for publications excluding print on demand (1MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-225513
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.22551
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 November 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Wirth and Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer and Prof. Dr. Gunter Meister and Prof. Dr. Michael Thomm |
| Date of exam: | 15 November 2010 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Keywords: | Endolysin, Bakteriophagen, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, VRE |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 22551 |
Abstract (German)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines bakteriolytisch aktiven Phagenproteins zur Bekämpfung von Infektionen durch die klinisch relevanten Stämme Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium. Nach der Isolierung von 31 lytischen Bakteriophagen gegen beide Stämme aus Umweltproben, wurden innerhalb des Genoms der gefundenen Phagen durch Homologiesuche passende ...
Abstract (German)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines bakteriolytisch aktiven Phagenproteins zur Bekämpfung von Infektionen durch die klinisch relevanten Stämme Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium.
Nach der Isolierung von 31 lytischen Bakteriophagen gegen beide Stämme aus Umweltproben, wurden innerhalb des Genoms der gefundenen Phagen durch Homologiesuche passende Endolysinsequenzen identifiziert. Die gefundenen Endolysine EPhL-20 aus dem Enterococcus faecalis-Phagen EPh-20 und EPhL-25 aus dem Enterococcus faecium-Phagen EPh-25 konnten rekombinant in E. coli exprimiert und aus E. coli gereinigt werden. Das Protein EPhL-20K bestand aus einer lytischen Domäne (N-Aceteylmuramoyl-L-Alanin-Amidase), welche über einen Linker mit einer putativen CBD und einer SH3b-Domäne mit Zellbindefunktion verbunden war. EPhL-25 bestand ebenfalls aus einer lytischen Domäne (N-Aceteylmuramoyl-L-Alanin-Amidase) und einer über einen Linker angeschlossenen putativen CBD.
Da das modifizierte Protein EPhL-20K unlöslich in inclusion bodies exprimierte, wurde eine Methode zu dessen Reinigung aus inclusion bodies, zur Solubilisierung und Renaturierung dieses Proteins etabliert. EPhL-25 konnte löslich aus E. coli gereinigt werden.
Für die Charakterisierung beider Proteine wurden verschiedene Methoden zur Testung der Funktion etabliert. Dazu gehörten Testverfahren wie der Platten- und Flüssigzelllysetest mit lebenden und hitzeinaktivierten Testbakterien, sowie die Bestimmung der minimalen bakteriziden- sowie minimalen inhibitorischen Konzentration der beiden Proteine. Diese Methoden waren vor allem für die Abschätzung der therapeutischen Eignung der Proteine notwendig.
EPhL-25 zeigte in diesen Tests eine höhere spezifische Aktivität gegen Enterococcus faecium als gegen Enterococcus faecalis, wobei allerdings nicht alle Isolate von Enterococcus faecalis lysiert wurden. EPhL-20K zeigte nur Aktivität gegen Enterococcus faecalis. Das Ziel der Arbeit, mit einem Protein alle Isolate der beiden Stämme Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium zu lysieren, wurde jedoch von keinem der beiden Proteine erreicht.
Die Herstellung eines chimären Proteins durch Kombination von Funktionsmodulen beider Proteine sollte das Problem der eingeschränkten Spezifität der beiden Ausgangsproteine lösen. Hierfür wurde das Protein EPhL-25, welches grundsätzlich die bessere spezifische Aktivität und Spezifität zeigte, um den Zellbindebereich des Proteins EPhL-20K erweitert. Dadurch sollte eine Verbesserung der Spezifität für Enterococcus faecalis erreicht werden, während die hohe Spezifität von EPhL-25 gegen Enterococcus faecium erhalten bleiben sollte.
Das neue Protein K-1 wurde, wie die beiden Ausgangsproteine, hinsichtlich Stabilität, Aktivität und Spezifität charakterisiert. Die erwartete Verbesserung der Spezifität gegenüber Enterococcus faecalis durch die zusätzliche CBD konnte bei K-1 festgestellt werden. Diese verbesserte Eigenschaft wurde allerdings auf Kosten der Löslichkeit und einer um 10°C verringerten Thermostabilität gegenüber EPhL-25 erreicht. Das neue Protein K-1 zeigte eine geringere spezifische Aktivität gegenüber Enterococcus faecium, während sich die spezifische Aktivität gegenüber Enterococcus faecalis erhöht hatte. Beim Vergleich der therapeutisch wichtigeren Daten der minimalen inhibitorischen Konzentration von K-1 mit den beiden Ausgangsproteinen zeigte sich, dass K-1 bei gleicher Proteinmenge mehr Zellen beider Teststämme lysierte als die beiden Ausgangsproteine. K-1 war in der Lage 99,95% der eingesetzten Testzellen beider Teststämme innerhalb einer Stunde zu lysieren. Die Ausgangsproteine erreichten diesen Wert entweder gar nicht (EPhL-20K), oder nur mit einem der beiden Teststämme (EPhL-25). Weitere Lyseversuche mit K-1 in humanem Blutserum zeigten, dass das Protein auch unter systemischen Bedingungen Aktivität besitzt.
Im Verlauf der Arbeit konnte gezeigt werden, dass es prinzipiell möglich ist, lytische Proteine wie Endolysine aus Bakteriophagen als potentielle therapeutische Wirkstoffe zur selektiven Bekämpfung von Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium zu gewinnen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass durch gezielte Kombination von Funktionsmodulen dieser Proteine eine Optimierung und Anpassung an bestimmte Vorgaben des therapeutischen Einsatzes möglich ist.
Translation of the abstract (English)
Aim of this thesis was the development of a bacteriolytic phage protein for treatment of infections, caused by the pathologic relevant strains Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium. 31 bacteriophages were isolated from environmental samples. Sequences of endolysins within the phageal genome were identified by homology search in genome databases. The identified endolysins, EPhL-20 from ...
Translation of the abstract (English)
Aim of this thesis was the development of a bacteriolytic phage protein for treatment of infections, caused by the pathologic relevant strains Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium.
31 bacteriophages were isolated from environmental samples. Sequences of endolysins within the phageal genome were identified by homology search in genome databases. The identified endolysins, EPhL-20 from the Enterococcus faecalis-phage Eph-20, and EPhL-25 from the Enterococcus faecium-phage Eph-25, could have been recombinantly expressed in E. coli and purified by liquid chromatography. EPhL-20 consisted of a lytical domain (N-Acetymuramoyl-L-Alanin-Amidase) connected to a putative CBD (Cell wall Binding Domain) by a linker. The CBD showed homology to a SH3b-domain. EPhL-25 showed similar domain architecture to EPhL-20. The CBD of EPhL-25 showed no significant homology to known CBD domains.
Due to the insoluble expression of EPhL-20 in inclusion bodies an optimised method for solubilisation and renaturation was established. EPhL-25 could have been purified from the soluble fraction of the E. coli cell lysate.
For protein characterisation different functional assays were developed. Different cell lysis assays were performed with living bacterias and heat killed cells as well. Furthermore the MIC (minimal inhibitory concentration) and the MBC (minimal bactericide concentration) of both proteins was determined. These tests were necessary for the estimation of the potential in therapeutically use.
EPhL-25 shows a higher specific lytic activity against Enterococcus faecium compared to Enterococcus faecalis. EPhL-25 was not able to lyse the whole tested spectrum of Enterococcus faecalis. In contrast to this, the lytic activity of EPhL-20 was limited to Enterococcus faecalis. The aim, to lyse all Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium isolates by a single protein, could not have been realized with one of the candidate endolysins.
To increase the restricted specificity, a chimeric protein was supposed to be constructed by combining functional domains of both primary endolysins. The protein EPhL-25 (showing a higher lytic activity and broader specificity) was extended by adding the cell wall binding domain of EPhL-20. Hereby the specificity for Enterococcus faecalis was supposed to be improved without affecting the high specificity for Enterococcus faecium in a negative way.
The resulting protein K-1 was characterised in terms of stability, activity and specificity. Due to the additional CBD a broader lytic spectrum against Enterococcus faecalis was detected. Compared to the primary Proteins, the specific lytic activity of K1 could have been increased against Enterococcus faecalis and decreased against Enterococcus faecium.
In therapeutically important MBC-assays, K1 lyses a higher rate of cells than the primary proteins. 99.95% of the tested bacterial cells from both strains were killed by K1 within one hour. Using EPhL-25, this value only could have been reached in cause of Enterococcus faecium, while EPhL-20 never achieved this value.
Although K1 showed better functional properties, the protein was expressed insoluble in inclusion bodies and the thermostability was reduced by 10°C.
The functional ability of K1 in systemic environment was demonstrated by lytic tests in human blood serum.
The potential therapeutically use of endolysins for selective treatment of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium infections was proved in this thesis. Furthermore the principle of optimisation for therapeutically use by combination of functional domains was approved.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 05:48
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