| License: Publishing license for publications excluding print on demand (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-225994
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.22599
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 25 November 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Ernst Tamm and Prof. Dr. Ludwig Aigner and Prof. Dr. Peter Flor |
| Date of exam: | 26 September 2011 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Humananatomie und Embryologie > Prof. Dr. Ernst Tamm |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | TGF-beta1, aNSZ, SVZ, Proliferation, Neuron, Elektrophysiologie, NMR |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 22599 |
Abstract (German)
Nach dem derzeitigen Stand der Wissenschaft existieren im adulten Gehirn zwei Regionen, in denen während des gesamten Lebens neue Nervenzellen gebildet werden: Dies ist zum einen die Subventrikulärzone (SVZ) der lateralen Ventrikel und zum anderen die Subgranulärschicht im Gyrus dentatus (GD) des Hippocampus (HC). Die kontinuierliche Bildung von Nervenzellen (Neurogenese) innerhalb dieser Areale ...
Abstract (German)
Nach dem derzeitigen Stand der Wissenschaft existieren im adulten Gehirn zwei Regionen, in denen während des gesamten Lebens neue Nervenzellen gebildet werden: Dies ist zum einen die Subventrikulärzone (SVZ) der lateralen Ventrikel und zum anderen die Subgranulärschicht im Gyrus dentatus (GD) des Hippocampus (HC). Die kontinuierliche Bildung von Nervenzellen (Neurogenese) innerhalb dieser Areale basiert auf der Präsenz von neuralen Stammzellen, die sich durch ihre Fähigkeit zur unbegrenzten Selbsterneuerung durch Teilung und das Potential zur Differenzierung in gliale (Astrozyten, Oligodendrozyten) und neuronale Zelltypen (Neurone) auszeichnen. Die Proliferation neuraler Stammzellen wird, neben weiteren Einflüssen, unter anderem durch Wachstumsfaktoren reguliert. Ein Faktor, der die Proliferation einer Vielzahl von Zellen moduliert, ist Transforming Growth Factor-beta1 (TGF-beta1). Im intakten Gehirn findet man das pleiotrope Zytokin vorwiegend im choroidalen Plexus und der Hirnhaut vor. Unter pathologischen Bedingungen wie Schlaganfall, Parkinson, Multiple Sklerose usw. wird der Wachstumsfaktor vorwiegend in Mikroglia, aber auch von neuronalen und astroglialen Zellen, in erhöhtem Maße exprimiert. Die Expression des für die Signalübertragung erforderlichen Rezeptors, TGFRII, lässt sich in beiden neurogenen Regionen des adulten Gehirns nachweisen; TGFRII-mRNA wird dort unter anderem in Neuronen, Astroglia und Mikroglia vorgefunden. Experimentelle Untersuchungen an Zellen aus der SVZ belegen, dass TGFRII-mRNA (und -Protein) darüber hinaus auch in adulten neuralen Stamm- und Vorläuferzellkulturen (aNSZ-Kulturen) exprimiert wird. Weiterführende Analysen konnten zudem zeigen, dass der Wachstumsfaktor TGF-beta1 das proliferative Potential dieser Kulturen verringert, während er das Selbsterneuerungs- und Differenzierungspotential nicht beeinflusst. Darüber hinaus sind die molekularen und zellulären Mechanismen der Kontrolle aNSZ durch TGF-beta1 jedoch weitgehend unbekannt, wenngleich verschiedene Aspekte zusätzliche Funktionen, unter anderem in Bezug auf das Zellschicksal aNSZ, vermuten lassen. Die vorliegende Arbeit beschreibt 1) die TGF-beta1-induzierte Regulation von 619 Genen in aNSZ-Kulturen unter Proliferationsbedingungen. Die signifikant regulierten Gene wurden im Rahmen der Identifizierung biologischer Funktionen unter anderem den „Gene Ontology“-Kategorien „Zellproliferation“ und „-wachstum“, „Regulation der Zellproliferation“, „Regulation des Zellzyklus“, „Neuron Reifung“, „Neuron Differenzierung“, „Determinierung des Zellschicksals“ sowie „Neurogenese“ zugeordnet. Die Arbeit zeigt außerdem, dass TGF-beta1 2) die Expression der zur Signalübertragung relevanten Rezeptoren tangiert; während die Expression von TGFRI unverändert blieb, wurde eine reduzierte Expression des alternativen TGFRI, Acvrl1, sowie eine signifikant erniedrigte TGFRII-Expression deutlich. 3) inhibitorisch auf die Zellproliferation aNSZ wirkt, indem es eine Teilpopulation der Zellen dazu veranlasst, aus dem Zellzyklus auszutreten; die Überführung in die G0-Phase resultierte in einer verminderten S-Phase bei konstanter G1- und G2/M-Phase-Fraktion im Vergleich zu Kontroll-Kulturen. 4) die Zellidentität proliferierender aNSZ beeinflusst. So führte die Inkubation aNSZ mit TGF-beta1 nachweislich zu einer verminderten Expression des neuroektodermalen Stammzellmarkers Nestin (Nes) und des oligodendroglialen Markers Myelin basic protein (Mbp), während sich die Zahl der Glial fibrillary acidic protein (GFAP)-positiven Astrozyten nicht signifikant änderte. Gleichzeitig erhöhte TGF-beta1 die Expression des neurogenese-assoziierten Proteins Doublecortin (Dcx), welches spezifisch in neuronalen Vorläuferzellen exprimiert wird. 5) Der Anstieg der neuronalen Zellpopulation in TGF-beta1-behandelten Kulturen spiegelte sich in einer zunehmenden Dichte der Natriumströme wider und korrelierte mit der Existenz von Aktionspotentialen. In Kontroll-Kulturen waren dagegen keine Natriumströme detektierbar; dementsprechend war keine der vermessenen Zellen in der Lage, infolge der Strominjektion ein Aktionspotential auszulösen. Im Gegensatz dazu ließen unter Differenzierungsbedingungen weder kontroll- noch TGF-beta1-behandelte Zellen Natriumströme erkennen, sodass es beiden Kulturen nicht möglich war, Aktionspotentiale zu generieren. Weiter verweist die vorliegende Arbeit auf 6) den Einfluss von TGF-beta1 auf aNSZ unter gezielten, oligodendroglialen Differenzierungsbedingungen. Die im Anschluss an die Differenzierung durchgeführte Analyse ergab - jeweils in Übereinstimmung mit den Daten, die unter Proliferationsbedingungen generiert wurden - keinen Einfluss auf die GFAP-Expression, allerdings eine signifikant reduzierte Anzahl an Mbp-exprimierenden Zellen. Des Weiteren führte die Kultivierung in mesenchymal-konditioniertem Medium zu einem vollständigen Verlust der Population A2B5-positiver, glialer Vorläuferzellen durch TGF-beta1, wohingegen der Wachstumsfaktor keinen Einfluss auf die Microtubule associated protein 2ab (Map2ab)-Expression zu haben schien. 7) die neuroprotektive Wirkung, welche TGF-beta1 auf aNSZ-Kulturen entfaltet. Die Inkubation aNSZ mit TGF-beta1 resultierte im Ausbleiben des spezifischen, mit Apoptose assoziierten Lipid-Signals bei 1.28 ppm, welches in Kontroll-Kulturen nachweisbar war. Die Quantifizierung des 1.28-ppm-Peaks ergab eine signifikant erniedrigte Lipid-Signalintensität in TGF-beta1-behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Darüber hinaus zeigten die erhobenen Daten, dass TGF-beta1 aNSZ sowohl vor nekrotischem Zelltod bewahrt als auch den Anteil an apoptotischen Zellen im Vergleich zur Kontrolle signifikant reduziert. 8) die - schon nach wenigen Tagen - verminderte Anzahl proliferierender Spheres in TGF-beta1-behandelten Kulturen, wenn TGF-beta1 von Beginn der Kultur an ins Nährmedium zugesetzt wurde. TGF-beta1-behandelte Kulturen wiesen außerdem, im Gegensatz zu Kontroll-Kulturen, adhärente Zellen mit teils neuron-artiger Morphologie auf. Darüber hinaus zeigten sich schon bald deutliche Unterschiede die Spheregröße betreffend; während in TGF-beta1-behandelten Kulturen nur vereinzelt Spheres von zudem geringer Größe anzutreffen waren, enthielten die Kontrollzellen eindeutig mehr und bei Weitem größere Spheres. Dementsprechend waren die ermittelten Zellzahlen am Ende von Passage 1 stark unterschiedlich. Die kontroll-behandelte Kultur expandierte stark; die Zellzahl der TGF-beta1-behandelten Kultur lag jedoch deutlich unter der ursprünglich ausgesäten Zahl an Zellen. Letztlich starben die TGF-beta1-behandelten Zellen nach der dritten Passage innerhalb weniger Tage. Die durch die vorliegende Arbeit gewonnenen Erkenntnisse sind von großer Relevanz, um die zukünftige Entwicklung von Medikamenten für die Therapie neurodegenerativer Erkrankungen voranzutreiben. Auch im Rahmen neurorekonstruktiver Therapieansätze lassen sich die Ergebnisse nutzen, um beispielsweise Zellen im Vorfeld einer Transplantation neuronal zu determinieren.
Translation of the abstract (English)
According to the current state of science, there exist two regions in the adult brain, in which new nerve cells are formed during the entire lifetime: this is the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and the subgranular zone in the dentate gyrus (DG) of the hippocampus (HC). The continuous generation of nerve cells (neurogenesis) within these areas is based on the presence of neural ...
Translation of the abstract (English)
According to the current state of science, there exist two regions in the adult brain, in which new nerve cells are formed during the entire lifetime: this is the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and the subgranular zone in the dentate gyrus (DG) of the hippocampus (HC). The continuous generation of nerve cells (neurogenesis) within these areas is based on the presence of neural stem cells, which are characterized by their ability for unlimited self-renewal through division and the potential to differentiate into glial (astrocytes, oligodendrocytes) and neuronal cell types (neurons). The proliferation of neural stem cells is, amongst others, regulated by growth factors. One factor, that modulates the proliferation of a variety of cell types, is Transforming Growth Factor-beta1 (TGF-beta1). In the intact brain, the pleiotropic cytokine is found predominantly in the choroidal plexus and the meninges. Under pathological conditions such as stroke, Parkinson's disease, multiple sclerosis etc. the growth factor is expressed predominantely in microglia, but largely in neuronal and astroglial cells, too. The expression of the signal transmission associated receptor TGFRII can be demonstrated in both neurogenic regions of the adult brain; TGFRII-mRNA is detected there amongst others in neurons, astroglia and microglia. Experimental analysis on SVZ cells show that TGFRII-mRNA (and protein) is, in addition, also expressed in adult neural stem and progenitor cell cultures (aNSZ cultures). Moreover, further analysis were able to reveal that the growth factor TGF-beta1 reduces the proliferative potential of these cultures, whereas the self-renewal and differentiation potential was not affected by TGF-beta1. Above all, however, the molecular and cellular mechanisms for control of aNSZ by TGF-beta1 are largely unknown, although various aspects suggest additional functions, among others, in relation to cell fate of aNSZ.
The present work describes 1) the TGF-beta1-induced regulation of 619 genes in aNSZ cultures under proliferation conditions. The significantly regulated genes have been assigned in line with the identification of biological functions to the "Gene Ontology"-categories "cell proliferation" and "cell growth", "regulation of cell proliferation", "regulation of the cell cycle", "neuron maturation", "neuron differentiation", "determination of cell fate" and "neurogenesis". The thesis also shows that TGF-beta1 2) affects the expression of relevant receptors for signal transmission; while the expression of TGFRI remained unchanged, a reduced expression of the alternative TGFRI, Acvrl1, as well as a significantly decreased TGFRII expression became apparent. 3) acts inhibitory on the proliferation of aNSZ by disposing a subpopulation of cells to leave the cell cycle; the conversion into the G0 phase resulted in a decreased S phase with constant G1 and G2/M phase fraction compared to control cultures. 4) affects the cell identity of proliferating aNSZ. Thus, after incubation of aNSZ with TGF-beta1, a reduced expression of the neuroectodermal stem cell marker Nestin (nes) and of the oligodendroglial marker myelin basic protein (mbp) could be demonstrated while the number of Glial Fibrillary acidic protein (GFAP) positive astrocytes did not change significantly. Simultaneously, TGF-beta1 increased the expression of the neurogenesis-associated protein Doublecortin (Dcx), which is specifically expressed in neuronal progenitor cells. 5) The increase of the neuronal cell population in TGF-beta1 treated cultures was reflected in an increasing density of sodium currents and correlated with the existence of action potentials. In contrast, no sodium currents were detectable in control cultures; accordingly, none of the cells measured was able to trigger an action potential as a result of current injection. Under differentiation conditions, neither control nor TGF-beta1 treated cells revealed sodium currents, hence, both cultures were not capable of generating action potentials. Further, the present work points to 6) the influence of TGF-beta1 on aNSZ under targeted, oligodendroglial differentiation conditions. The analysis carried out following differentiation showed - in accordance with the data generated under proliferation conditions - no influence on GFAP expression, but a significantly reduced number of mbp expressing cells. Furthermore, the cultivation in mesenchymal-conditioned medium resulted in a complete loss of the population of A2B5-positive, glial progenitor cells by TGF-beta1, whereas the growth factor seemed to have no effect on the Microtubule associated protein 2 (Map2ab) expression. 7) the neuroprotective action TGF-beta1 exerts on aNSZ cultures. The incubation of aNSZ with TGF-beta1 resulted in the absence of the specific, apoptosis associated lipid signal at 1.28 ppm, which could be detected in control cultures. The quantification of the 1.28 ppm peak revealed a significantly decreased intensity of the lipid signal in TGF-beta1 treated cells compared to control. In addition, the data showed that TGF-beta1 preserves aNSZ from necrotic cell death as well as significantly reduces the proportion of apoptotic cells in comparison to the control. 8) the - already after a few days - reduced number of proliferating spheres in TGF-beta1 treated cultures, when TGF-beta1 was added into the culture medium at the beginning of the culture. Moreover, in contrast to control cultures, TGF-beta1 treated cultures exhibited adherent cells with partly neuron-like morphology. In addition, marked differences concerning the sphere size became apparent soon; whereas only few spheres of small size were found in TGF-beta1 treated cultures, control cells contained clearly more and by far greater spheres. Accordingly, the calculated cell numbers at the end of passage 1 varied intensely. The control culture expanded strongly; however, the cell number of the TGF-beta1 treated culture was clearly below the number of cells that were initially seeded. Ultimately the TGF-beta1 treated cells died within a few days after the third passage.
The knowledge gained by this work are of great relevance to advance the future development of drugs for the therapy of neurodegenerative disorders. The results can be also used in the context of neuroreconstructive therapeutic approaches, for example to induce a neuronal cell fate in adult neural stem and progenitor cells prior to transplantation.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 05:48
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