Virtuelles und NMR basiertes Screening zur Ermittlung neuer Liganden für das H-Ras-Protein sowie Charakterisierung der Ligand-Protein-Wechselwirkungen mittels (1H-15N)-sofast-HMQC-Spektroskopie

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	16 November 2012
Referee:	Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer and apl. Prof. Dr Werner Kremer
Date of exam:	11 November 2011
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer
Keywords:	Ras, Krebs, Inhibitor
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	22611

Abstract (German)

Ziel dieser Arbeit war es, durch virtuelle und STD-NMR basierte Screenings neue Liganden für aktives Ras in Zustand 1 zu identifizieren. Dazu sollte sowohl das virtuelle als auch das in Teilen automatisierte STD-NMR-Screening zunächst am Lehrstuhl für Biophysik etabliert werden. Für den ersten Schritt, das virtuelle Screening mit dem Programm LUDI, war zunächst die Erstellung geeigneter, ...

Abstract (German)

Ziel dieser Arbeit war es, durch virtuelle und STD-NMR basierte Screenings neue Liganden für aktives Ras in Zustand 1 zu identifizieren. Dazu sollte sowohl das virtuelle als auch das in Teilen automatisierte STD-NMR-Screening zunächst am Lehrstuhl für Biophysik etabliert werden. Für den ersten Schritt, das virtuelle Screening mit dem Programm LUDI, war zunächst die Erstellung geeigneter, virtueller 3D Strukturdatenbanken und die Modifizierung der 3D Proteinstruktur von c’Ras(T35A)•Mg2+•GppNHp nötig. Bei dem virtuellen Screening waren zwei Ansätze interessant. Zum einen das Screening direkt im aktiven Zentrum, an gleicher Position neben dem P des Nukleotids wo auch Zn2+-Cyclen bindet, und zum andern an definierten Positionen nahe des aktiven Zentrums um eine spätere Verlinkung zu ermöglichen. Nach Ermittlung virtueller Liganden wurden diese auf reale Bindung am Ras-Protein mittels STD-NMR überprüft. Ein reales Screening von 500 Substanzen der Maybridge RO3 Fragment Library an c’Ras(T35A)•Mg2+•GppNHp mittels STD-NMR identifizierte weitere neue Liganden für aktives Ras in Zustand 1.
Die entsprechenden Bindungspositionen und Bindungskonstanten von den neuen Liganden wurden dann durch Molecular Modeling mit LUDI und (1H-15N)-sofast-
HMQC-Titrationen ermittelt. Ob diese Liganden in der Lage sind, das konformationelle Gleichgewicht in Ras(wt) hinzu Zustand 1 zu verschieben, wurde daraufhin mittels 31P-NMR überprüft.
Eine weitere Aufgabe stellte die Expression, Aufreinigung und Charakterisierung einer neuen Mutante von Ras, c‘Ras(T35A, H166A), dar. Diese Mutante wurde mit c’Ras(T35A)•Mg2+•GppNHp hinsichtlich ihrer 2D Spektren und der Bindung von Zn2+-Cyclen und Zn2+-BPA verglichen.

Translation of the abstract (English)

The aim of this work contained a virtual and STD-NMR based screening to identify new ligands for active ras in state 1. For the first step, the virtual part, the preparation of a virtual 3D structural database and the modification of the 3D proteinstructure of c’Ras(T35A)•Mg2+•GppNHp was necessary. Two approaches for the virtual screening were important. First, the screening directly in the ...

Translation of the abstract (English)

The aim of this work contained a virtual and STD-NMR based screening to identify new ligands for active ras in state 1. For the first step, the virtual part, the preparation of a virtual 3D structural database and the modification of the 3D proteinstructure of c’Ras(T35A)•Mg2+•GppNHp was necessary. Two approaches for the virtual screening were important. First, the screening directly in the active site and second, at defined positions near the active site to enable a later linkage. After the identification of virtual ligands they were testet on real binding using STD-NMR. A real screening of 500 substances of the maybridge library identified further new ligands for active ras in state 1. According binding positions and constants were determined using molecular modeling with LUDI as well as (1H-15N)-sofast-HMQC-titrations. It was testet whether these ligands are able to swith the conformational equilibrium in ras(wt) into state 1 using 31P-NMR. Another aim was the expression, purification and characterisation of a new mutant of ras, c‘Ras(T35A, H166A).

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