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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-230249
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
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Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 22 Januar 2013 |
Begutachter (Erstgutachter): | PD Dr. Wulf Schneider |
Tag der Prüfung: | 28 Oktober 2011 |
Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
Stichwörter / Keywords: | TNFR1- signalling, TNF alpha, Phagosomen, Phagolysosom, bakterielle Abwehr, Listeria monocytogenes |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 23024 |
Zusammenfassung (Englisch)
The contribution of tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) and tumor necrosis factor receptor-1 (TNF-R1) to the eradication process of intracellular bacteria is well-known and undisputed. Mice deficient in TNF-R1 or components of TNF-R1 signalling (acid sphingomyelinase or ASMase) were strongly impaired in their capacity to kill Listeria monocytogenes (L.m.) and died upon infection with low ...
Zusammenfassung (Englisch)
The contribution of tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) and tumor necrosis factor receptor-1 (TNF-R1) to the eradication process of intracellular bacteria is well-known and undisputed. Mice deficient in TNF-R1 or components of TNF-R1 signalling (acid sphingomyelinase or ASMase) were strongly impaired in their capacity to kill Listeria monocytogenes (L.m.) and died upon infection with low doses of this pathogen (Pfeffer et al., 1993; Utermöhlen et al., 2003). Upon TNF alpha stimulation, TNF-R1 internalises and throughout the endocytic trafficking pathway fuses with trans-golgi-vesicles and forms multivesicular structures known as late receptosomes. These compartments were shown to contain activated cathepsin D (CTSD) within their lumen (Schneider-Brachert et al., 2004). Over the last decades, reactive oxygen species (ROS), generated by NADPH oxidase complex and generation of reactive nitrogen intermediates (RNI) by the inducible nitric oxide synthase (iNOS) have been assumed to be the major effector components in the bacterial eradication process (Aktan, 2004; Nauseef, 2004; Segal, 2005). In the recent years, however, it has been established that lysosomal proteases contribute to the effective control of infectious pathogens with similar importance (Segal, 2005; Cerro-Vadillo et al., 2006; Utermöhlen et al., 2008; Carrasco-Marin et al. 2009). In particular, the aspartyl-protease CTSD was shown to be an important effector molecule in listerial killing. Mice expressing a truncated form of this protease are highly susceptible to infection with the intracellular bacterium L.m. (Cerro-Vadillo et al., 2006). In addition, CTSD was shown to target in particular one specific virulence factor of the pathogen L.m., the cytolysin Listeriolysin O (LLO). This virulence factor is one of the major determents of listerial infection because it enables the pathogen to escape into the cytoplasm and therefore to evade the degradative environment of the phagolysosomal compartment. CTSD was suggested to cleave this protein, resulting in the inactivation of its pore-forming activity and preventing the escape of the pathogen out of the phagosome (Carrasco-Marin et al., 2009).
Based on these earlier findings, in the present study it was hypothesised that the biological function of TNF-R1 internalisation might be a key mechanism for routing bactericidal products such as protease CTSD towards the bacteria-containing phagosome. Proving that internalised TNF-R1 receptosomes fuse with the L.m.-containing phagosome was considered to be a fundamental step, as it had not been contemplated in previous studies. For the first time, this finding was confirmed by several methods including confocal microscopy, transmission electron microscopy and Western blot analysis of isolated L.m.-containing phagosomes and isolated TNF-R1-receptosomes. The cytokine driven molecular mechanisms in bacterial killing were examined in further experiments. In bacterial growth assays, the microbicidal properties of the cytokines TNF alpha and IFN gamma were tested in different macrophage populations infected with L.m. TNF alpha stimulation alone was insufficient to control bacterial growth in all tested macrophages. Stimulation of macrophages with IFN gamma, however, resulted in restriction of bacterial propagation. TNF-R1-/- macrophages, in turn failed to control listerial growth even upon IFN gamma stimulation, suggesting a relevant contribution of TNF-R1 signalling to IFN gamma mediated infection control. A general synergism of IFN gamma and TNF alpha during the bacterial eradication process seems to be the only plausible explanation, and was confirmed with the results of this work. The precise underlining molecular mechanism of bacterial eradication mediated by TNF-R1 was further investigated. In order to analyse specific alteration of the protein composition on bacteria-containing phagosomes influenced by TNF-R1 signalling, a new immunomagnetic approach for the isolation of these compartments was applied and adapted for the use of L.m. and J774 macrophages.
Monitoring the cytokine specific effects on isolated bacteria-containing phagosomes could show that TNF alpha stimulation alone was sufficient to activate CTSD on the phagosome in J774 macrophages, although bacterial growth restriction failed upon TNF alpha stimulation. Concomitantly, irrespective of TNF-R1 or IFN gamma receptor (IFN gamma R) knockout condition and of any given cytokine stimulation, primary cells showed activation of CTSD on bacteria-containing phagosomes. This was observed in cells where no bacterial growth restriction occurred. These results suggest that CTSD might not be the bactericidal molecule assumed to mediate TNF-R1 dependent bacterial killing and questions its essential role in the eradication process in general.
Other proteins known to be involved in the bacterial infection control such as Rab5, LRG-47 and iNOS were analysed in order to find molecules that might be involved TNF-R1-mediated signals for the bactericidal mechanisms. The small GTPase Rab5 seems to be an interesting candidate as it failed to appear on phagosomes of TNF alpha and non stimulated TNF-R1 deficient macrophages and in addition, on phagosomes of IFN gamma R deficient macrophages.
In conclusion, this work demonstrated for the first time that TNF-R1 becomes a part of L.m.-containing phagosomes and that TNF-R1-receptosomes fuse with this compartment after internalisation. At this stage several components known to be involved in bacterial eradication process, were monitored in order to find a component that is associated to TNF-R1 signalling. CTSD does not seem to fulfil the promising molecular role it was previously assumed to have. It may however be involved in bacterial killing, but it seems to be insufficient for mediating eradication of L.m., which stays in contrast to previously published work. The GTPase Rab5 might be an interesting component in the context of TNF alpha mediated killing but it needs further investigations. In addition, a new method for the isolation of bacteria-containing phagosomes was applied and validated for the use of the pathogen L.m. and J774 macrophages.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die Abwehr intrazellulärer Erreger wie Listeria monocytogenes (L.m.) erfolgt unter Beteiligung des Zytokins TNF alpha und seines Rezeptors TNF-R1. Dies konnte an Mäusen gezeigt werden, die entweder defizient für den TNF-R1 sind, oder Defekte in der TNF alpha-vermittelten Aktivierung von Proteasen, z.B. der sauren Sphingomyelinase (ASMase), aufweisen und deshalb die Infektion nicht mehr ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die Abwehr intrazellulärer Erreger wie Listeria monocytogenes (L.m.) erfolgt unter Beteiligung des Zytokins TNF alpha und seines Rezeptors TNF-R1. Dies konnte an Mäusen gezeigt werden, die entweder defizient für den TNF-R1 sind, oder Defekte in der TNF alpha-vermittelten Aktivierung von Proteasen, z.B. der sauren Sphingomyelinase (ASMase), aufweisen und deshalb die Infektion nicht mehr kontrollieren können (Pfeffer et al., 1993; Utermöhlen et al., 2003). Während ursprünglich ROS (reactive oxygen species) und RNI (reactive nitrogen intermediates) für lange Zeit als die entscheidenden Komponenten der Eradikation intrazellulärer Erreger gehalten wurden (Aktan et al., 2004; Nauseef et al.,2004; Segal et al., 2005), gewannen in den letzten Jahren auch lysosomale Proteasen wie Cathepsin D (CTSD) in diesem Zusammenhang immer mehr an Bedeutung (Segal, 2005; Cerro-Vadillo et al., 2006; Utermöhlen et al., 2008; Carrasco-Marin et al., 2009). CTSD bewirkt die Spaltung und Inaktivierung von Listeriolysin O (LLO), das eines der wichtigsten Virulenzfaktoren von L.m. ist, und verhindert die Lyse der Phagosomenmembran und damit Translokation der Bakterien ins Zytoplasma (Carrasco-Marin et al., 2009). Die Bakterien werden im Phagosom festgehalten, können sich nicht vermehren und werden schließlich im sauren Milieu des Phagolysosoms abgetötet. Schneider et al. konnten vor wenigen Jahren zeigen, dass die Stimulation von Zellen mit TNF alpha zur Internalisierung des TNF-R1 führt, wobei sich das sog. Rezeptosom, das sind frühe endosomale Kompartimente, und nach Fusionen mit trans-Golgi Vesikeln multivesikuläre Strukturen entwickeln, die aktiviertes CTSD enthalten (Schneider-Brachert et al., 2004). Basierend auf diesen Erkenntnissen entstand die Hypothese, die Internalisierung des TNF-R1 und die Bildung spezifischer endosomaler Vesikel als bakteriziden Mechanismus der Zelle zu begreifen, bei dem die aktive Protease CTSD zum Listerien-haltigen Phagosom gebracht werden könnte, um die Infektion sowohl zu kontrollieren als auch zu terminieren. Die Fusion von TNF-R1-Rezeptosomen und Phagosomen stellt hier das Schlüsselereignis der Hypothese dar. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal, unter Verwendung verschiedener experimenteller Ansätze, die Verschmelzung von TNF-R1-haltigen Vesikeln und Listerien-haltigen Phagosomen gezeigt werden. Durch die Etablierung einer neuen Methode zur Aufreinigung magnetisch markierter Listerien gelang es, Phagosomen aus infizierten Makrophagen zu isolieren und ihre Proteinzusammensetzung im Western Blot zu analysieren. Dabei konnte der TNF-R1 spezifisch in diesem phagosomalen Kompartiment gemeinsam mit Listerien nachgewiesen werden. Im Elektronenmikroskop wurde dies mit Hilfe von Goldpartikel-markierter TNF-Rezeptoren auch visuell bestätigt.
Da ein synergistischer Effekt von IFN gamma und TNF alpha bei der Infektionsbekämpfung in Makrophagen bereits bekannt war, wurde zunächst die bakterizide Wirkung von TNF alpha und IFN gamma auf verschiedene Makrophagenpopulationen (J774 Makrophagen und Knochenmarksmarkrophagen aus Wildtyp, TNF-R1-/- und IFN gamma Rezeptor -/- Mäusen) untersucht. Die Experimente zur bakteriziden Eigenschaft dieser Zytokine zeigten, dass allein die Stimulation mit TNF alpha die Vermehrung der Bakterien nicht verhindern konnte, eine Co-Stimulation mit IFN gamma jedoch zu einer Stagnation des bakteriellen Wachstums resultierte. In Infektionsversuchen mit den TNF-R1-defizienten Makrophagen konnte gezeigt werden, dass trotz IFN gamma-Stimulation die Translokation der Listerien ins Zytoplasma nicht verhindert werden kann. Diese Ergebnisse bestätigen auf Grundlage der Phagosomenanalyse, dass zur Infektionskontrolle ein generelles synergistisches Zusammenspiel beider Zytokine zur Bakterieneradiaktion notwendig ist.
Um die spezifische Rolle des TNF-R1 bzw. der TNF alpha-mediierten Signalwege besser zu verstehen und die molekularen Veränderungen bedingt durch den TNF alpha/TNF-R1-Komplex am Phagosom zu untersuchen, wurden Phagosomen zu verschiedenen Zeitpunkten aus Listerien-infizierten Makrophagen isoliert. Zur Trennung der TNF alpha- und IFN gamma- spezifischen Effekte wurden nicht nur WT-Makrophagen, sondern auch TNF-R1-/-, sowie IFN gamma Rezeptor -/- (IFN gamma R -/-) Makrophagen verwendet. Die Analyse der Phagosomen im Western Blot ergab, dass die Stimulation mit TNF alpha in diesen Zellen die Aktivierung von CTSD im Phagosom zur Folge hatte, jedoch TNF-R1- und IFN gamma R-defiziente Makrophagen nach der Infektion ebenfalls eine Aktivierung von CTSD am Phagosom zeigten. Die Freisetzung und Vermehrung der Bakterien wurde durch die Aktivierung der Protease aber nicht verhindert. Somit war feststellbar, dass die Stimulation mit TNF alpha zwar die Aktivierung von CTSD in J774 Makrophagen induzieren kann, dies aber für eine erfolgreiche Infektionskontrolle nicht ausreichend ist. Nur die alleinige Aktivierung von CTSD am Phagosom scheint somit für die Eradikation der Bakterien nicht hinreichend zu sein, was im Widerspruch zu bereits publizierten Daten steht. Daher wurde zusätzlich die Rekrutierung weiterer Proteine, wie Rab5, iNOS und LRG-47, die für ihre Beteiligung an der Infektionskontrolle bekannt sind, an das Phagosom untersucht. Interessanterweise konnte dabei festgestellt werden, dass die GTPase Rab5 unabhängig von einer TNF alpha-Stimulation sowohl in TNF-R1- als auch in IFN gammaR-defizienten Makrophagen am Phagosom nur schwach bis gar nicht nachweisbar war.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals eine neue Methode zur Isolierung Listerien-haltiger Phagosomen etabliert werden. Die ursprüngliche Arbeitshypothese, dass es zu einer Fusion von TNF-R1-Rezeptosomen und Listerien-haltigen Phagosomen kommt, konnte mit mehreren unabhängigen Methoden erfolgreich verifiziert werden. Durch die Analyse magnetisch isolierter Phagosomen konnte zwar eine teilweise Beteiligung des TNF alpha-Stimulus zur Aktivierung der Protease CTSD (in J774 Makrophagen) nachgewiesen werden, die aber zur Eradikation der intraphagosomalen Bakterien nicht ausreichend war. Die Beobachtung, dass in Listerien-haltigen Phagosomen von IFN gamma R-defizienten Zellen die CTSD-Aktivierung am stärksten war, deutet darauf hin, dass auch die Rolle von CTSD für die Kontrolle der Listerieninfektion generell in Frage gestellt werden muss. Interessanterweise konnte für die GTPase Rab5 eine mögliche Beteiligung im TNF alpha-mediierten Infektionsabwehrprozess aufgezeigt werden, da sie in TNF-R1-defizienten Zellen nicht mehr ans Phagosom rekrutiert wird.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 15:25