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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-230937
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.23093
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 10 February 2012 |
| Referee: | PD Dr. Wulf Schneider |
| Date of exam: | 10 January 2012 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Keywords: | HA-MRSA, CA-MRSA, PVL, mecA Gen, Oxacillinresistenz, MRSA Diagnostik, Routinemethoden, Resistenztest, Chromogene Nährmedien, mecA gene, resistance to oxacillin, MRSA diagnostics, routine methods, resistance testing methods, chromogenic media |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 23093 |
Abstract (German)
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der bedeutendsten Erreger bakterieller Infektionen. Er ist äußert weit verbreitet und ist besonders in gesundheitlichen Einrichtungen zu einem Problem geworden (KISS; www.nrz-hygiene.de). Doch nicht nur aufgrund der Häufigkeit seines Auftretens, sondern auch aufgrund seiner Virulenz und Anpassungsfähigkeit stellt S. aureus eine klinische Herausforderung ...
Abstract (German)
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der bedeutendsten Erreger bakterieller Infektionen. Er ist äußert weit verbreitet und ist besonders in gesundheitlichen Einrichtungen zu einem Problem geworden (KISS; www.nrz-hygiene.de). Doch nicht nur aufgrund der Häufigkeit seines Auftretens, sondern auch aufgrund seiner Virulenz und Anpassungsfähigkeit stellt S. aureus eine klinische Herausforderung dar [1]. Krankheitsbilder reichen von nicht selten rezidivierenden, pyogenen Infektionen bis hin zu schweren systemischen Erkrankungen mit hoher Letalität. Über die Jahre entwickelten sich überdies zahlreiche neue S. aureus-Varianten, welche wie der bekannte Methicillin resistente S.aureus (MRSA) oft mehrere Antibiotikaresistenzen aufweisen, was die Behandlung zusätzlich anspruchsvoller gestaltet. Umso bedeutender ist daher die zügige Einleitung einer adäquaten Therapie, welche eine möglichst rasche, korrekte Diagnostik voraussetzt.
Als Goldstandard der MRSA-Diagnostik gilt der Direktnachweis des mecA-Gens mittels PCR bzw. der Nachweis des Genprodukts von mecA, PBP2a, durch monoklonale Antikörper. Diese Methoden liefern zuverlässige Ergebnisse innerhalb weniger Stunden [2], stehen jedoch aus organisatorischen oder finanziellen Gründen nicht in jedem Fall zur Verfügung. Verfahren zur Testung der Oxacillinresistenz sind kostengünstiger und erfordern weniger technischen Aufwand, weshalb sie in der MRSA-Diagnostik als Routinemethoden gelten. Sie sind jedoch zeitaufwendiger und haben den Nachteil, dass im Einzelfall eine korrekte Diagnose durch im Mechanismus der Oxacillinresistenz begründete Probleme erschwert werden kann.
Seit einigen Jahren wird weltweit eine neue Variante von MRSA beobachtet, die außerhalb von Krankenhäusern bei Patienten ohne Risikofaktoren auftritt [3], und deswegen auch „community associated“-MRSA (CA-MRSA) genannt wird. CA-MRSA tragen häufig den Pathogenitätsfaktor Panton-Valentine Leukozidin (PVL) und sind oft nur gegen wenige Antibiotikasubstanzklassen resistent. Sie sind meist heteroresistent und weisen manchmal MHK-Werte für Oxacillin auf, die im Mittel niedriger sind als bei „hospital associated“-MRSA (HA-MRSA) [4], was wie oben erwähnt Schwierigkeiten bei der Resistenztestung mit sich bringen kann.
Es stellt sich also die Frage, ob CA-MRSA zuverlässig mit Routinemethoden zur Resistenztestung bzw. MRSA-Screening erkannt werden.
Anhand einer Auswahl von 37 S. aureus-Stämmen (MRSA mit PVL: n = 25; MRSA ohne PVL: n = 9; MSSA: n = 3) wurden verschiedene auf der Resistenztestung beruhende Methoden zur Diagnostik von MRSA untersucht: Oxacillin Agar Screen nach CLSI, Bestimmung der MHK für Oxacillin und Cefoxitin mittels Etest®, Agardiffusion mit Cefoxitin, sowie die chromogenen Nährmedien „CHROMagar® MRSA“, „chromID MRSA®“, „MRSASelect®“ und „Chromogener MRSA-Selektivnährboden“.
Um zu untersuchen, ob möglicherweise Unterschiede bezüglich der Empfindlichkeit bei anderen Antibiotika bestehen, erfolgte außerdem die Ermittlung der MHK für Vancomycin, Fusidinsäure, Clindamycin, Linezolid, Doxycyclin, Moxifloxacin, Tigecyclin, Rifampicin, SXT und Mupirocin mittels Etest®, sowie mittels Agardiffusion für Gentamicin und Kanamycin. Zusätzlich wurden die NaCl-Toleranz, die Hitzetoleranz, sowie phänotypisch zu beobachtende Wachstumsveränderungen bei 42°C im Vergleich zu 37°C bestimmt, um ein eventuell unterschiedliches Wachstumsverhalten von MRSA mit bzw. ohne PVL unter verschiedenen Kulturbedingungen zu untersuchen.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass MRSA mit PVL im Vergleich zu MRSA ohne PVL (1) niedrigere MHK-Werte für Oxacillin, Cefoxitin, Clindamycin und SXT aufweisen, (2) selten einen multiresistenten Phänotyp zeigen, (3) sich in allgemeinen Wachstumseigenschaften (Pigmentierung auf Chrom-Platten, Salztoleranz, Hitzetoleranz) nicht unterscheiden, (4) durch die folgenden Methoden gleichermaßen als methicillinresistent erkannt werden können: mecA-Gennachweis, PBP2a-Antigennachweis, Oxacillin-MHK, Cefoxitin-MHK, Cefoxitin-Blättchendiffusion, chromogene Nährböden chromID MRSA® und Chromogener MRSA-Selektivnährboden (jeweils innerhalb 24 h).
Die Ergebnisse dieser Arbeit zur Tauglichkeit der einzelnen phänotypischen Methoden müssen mit Vorbehalt interpretiert werden. Zum einen wurde lediglich deren Sensitivität untersucht, zur Spezifität können keine Aussagen gemacht werden. Zum anderen sind die Ergebnisse zur Sensitivität der untersuchten Medien nicht vergleichbar mit Ergebnissen anderer Studien des Nachweises von MRSA aus klinischen Proben, weil als Besonderheit dieser Arbeit ein speziell selektiertes Panel von (klinischen) S. aureus-Isolaten mit PVL aus unterschiedlicher Herkunft verwendet wurde. Des Weiteren wurde pro Gruppe nur eine geringe und verschieden große Anzahl von Stämmen getestet.
Unsere Ergebnisse bezüglich Cefoxitin decken sich mit Ergebnissen anderer Studien, die Cefoxitin Zuverlässigkeit beim Nachweis der Oxacillin-Resistenz bescheinigen [5], [6], [7], [8]. Beobachtungen anderer Autoren zur mangelnden Sensitivität Oxacillin-basierter Nachweismethoden nach 24h können durch unsere Ergebnisse ebenfalls bestätigt werden, [9], [10], [11]. Dieses Phänomen mag unter anderem auf die Heterogenität der Expression bzw. eine unzureichende Induktion zurückgeführt werden. Beim Nachweis der Methicillinresistenz durch Resistenztestung besteht generell das Problem in der Erkennung von Stämmen mit MHK-Werten, die nahe an oder unter den offiziellen Grenzwerten liegen. Bei typischem Krankheitsbild sollte daher in Zweifelsfällen zusätzlich die Bestimmung des mecA-Gens bzw. des PBP2a-Antigens erwogen werden. Hierbei handelt es sich jedoch um Einzelfälle. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass bestimmte Methoden der Resistenztestung die Oxacillinresistenz auch bei MRSA mit PVL zuverlässig nachweisen können. Demnach haben diese Methoden im Routinelabor als kostengünstige, wenn auch langsamere Alternative zu den Methoden des Nachweises des mecA-Gens und dessen Genprodukts PBP2a durchaus ihre Berechtigung.
[1]
Holden MTG et al.
Complete Genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: Evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance.
Proc. Natl. Acad. Sci. of the USA 2004; 101: 9786-9791.
[2]
Reischl U, Linde HJ, Metz M, Leppmeier B et al.
Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and simultaneous species confirmation using real-time fluorescence PCR.
J. Clin. Microbiol. 2000; 38: 2429-2433.
[3]
Herold BC, Immergluck LC, Maranan MC, Lauderdale DS, Gaskin RE, Boyle- Vavra S, Leitch CD, Daum RS.
Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in children with no identified predisposing risk.
JAMA 1998; 279:593-598.
[4]
Okuma K, Iwakawa K, Turnidge JD, Grubb WB et al.
Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community.
J.Clin.Microbiol. 2002; 40: 4289-4294.
[5]
Felten A, Grandry B, Lagrange PH, Casin I.
Evaluation of three techniques for detection of low-level methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): a disk diffusion method with cefoxitin and moxalactam, the Vitek 2 system, and the MRSA-screen latex agglutination test.
J. Clin. Microbiol. 2002; 40: 2766-2771.
[6]
Fang H, Hedin G.
Use of cefoxitin-based selective broth for improved detection of methicillin- resistant Staphylococcus aureus.
J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 592-594.
[7]
Perry JD, Davies A, Butterworth LA, Hopley AL et al.
Development and evaluation of a chromogenic agar medium for methicillin- resistant Staphylococcus aureus.
J. Clin. Microbiol. 2004; 42: 4519-4523.
[8]
Skov R, Smyth R, Larsen AR, Bolmstrom A et al.
Phenotypic Detection of Methicillin Resistance in Staphylococcus aureus by Disk Diffusion Testing and Etest on Mueller-Hinton Agar.
J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 4395-4399.
[9]
Becker K.
Diagnostik von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA)- Stämmen. Teil 2. Nachweis der Methicillin/Oxacillin-Resistenz bei Staphylococcus aureus.
Mikrobiologie 2004; 14: 41-50
[10]
Ben Nsira S, Dupuis M, Leclercq R.
Evaluation of MRSA Select, a new chromogenic medium for the detection of nasal carriage of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.
Int. J. Antimicrob. Agents 2006; 27: 561-564.
[11]
Swenson JM, Spargo J, Tenover FC, Ferraro MJ.
Optimal inoculation methods and quality control for the NCCLS oxacillin agar screen test for detection of oxacillin resistance in Staphylococcus aureus.
J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 3781-3784.
Translation of the abstract (English)
Staphylococcus aureus (S. aureus) is one of the most important agents of bacterial infection. It is widely-spread and has become a problem especially in health institutions (KISS; www.nrz-hygiene.de). However, S. aureus poses a clinical challenge not only due to its frequency of occurrence, but also due to its virulence and ability to adapt [1]. The clinical picture varies from often recurrent, ...
Translation of the abstract (English)
Staphylococcus aureus (S. aureus) is one of the most important agents of bacterial infection. It is widely-spread and has become a problem especially in health institutions (KISS; www.nrz-hygiene.de). However, S. aureus poses a clinical challenge not only due to its frequency of occurrence, but also due to its virulence and ability to adapt [1]. The clinical picture varies from often recurrent, pyogenic infections to severe systemic affections with a high lethal outcome. Moreover, numerous new S. aureus mutants have developed over the years. Like for example the well known Meticillin Resistant S. aureus (MRSA) they often exhibit resistances to several antibiotics, which makes treatment even more challenging. This makes the swift initiation of an adequate therapy even more important, which calls for speedy and reliable diagnostics.
The direct detection of the mecA gene through PCR, as well as the detection of PBP2a, the gene product of mecA, through monoclonal antibodies, are regarded as the golden standard of MRSA diagnostics. These methods give reliable results within hours [2], but for financial and organisational reasons are not always available. Methods testing the resistance to oxacillin are more cost effective and require less technological input and are therefore routinely used in MRSA diagnostics. However, these methods are more time consuming and have the disadvantage that in some cases finding the correct diagnosis can be difficult due to problems resulting from the mechanism of the resistance to oxacillin.
For several years now new mutants of MRSA have been observed worldwide, which are found outside hospitals with patients showing no risk factors [3] and are therefore called „community associated“-MRSA (CA-MRSA). CA-MRSA frequently carry the pathogenic factor Panton-Valentine-Leukocidine (PVL) and often are resistant only to few types of antibiotics. They are mostly hetero-resistant and sometimes their average MIC for oxacillin is lower than in “hospital associated”-MRSA (HA-MRSA) [4], which as mentioned before, can cause problems in methods testing resistance to oxacillin.
This poses the question, if CA-MRSA can be reliably detected by resistance testing based routine methods, or MRSA screening methods, respectively.
Using a selection of 37 S. aureus strains (MRSA with PVL: n = 25; MRSA without PVL: n = 9; MSSA: n = 3) several resistance testing based routine methods of MRSA diagnostics were examined: Oxacillin Agar Screen according to CLSI, determination of the MIC for oxacillin and cefoxitin by means of Etest®, agar diffusion with cefoxitin, as well as the chromogenic culture media „CHROMagar® MRSA“, „chromID MRSA®“, „MRSASelect®“ and „Chromogener MRSA-Selektivnährboden“. In order to examine whether there might be differences in sensitivity to other antibotics the MIC for vancomycin, fusidic acid, clindamycin, linezolid, doxycyclin, moxifloxacin, tigecyclin, rifampicin, co-trimoxazole and mupirocin were determined by means of Etest®, the MIC for gentamicin and kanamycin by means of agar diffusion. Additionally, in order see whether there might be any differences in growth between MRSA with or without PVL under various culture conditions, the tolerance towards NaCl and the tolerance towards heat were examined, as well as phenotypical changes in growth at 42°C compared to growth at 37°C.
We can conclude that MRSA with PVL, as compared to MRSA without PVL, (1) have lower MICs for oxacillin, cefoxitin, clindamycin and co-trimoxazole , (2) rarely show a multi-resistant phenotype, (3) do not differ in general growth characteristics (pigmentation on chromogenic agar, tolerance towards NaCl or heat), (4) can be recognized as meticillin resistant equally by the following methods: detection of the mecA gene, detection of the antigene PBP2a , MIC for oxacillin, MIC for cefoxitin, agar diffusion for cefoxitin, chromogenic agars chromID MRSA® and Chromogener MRSA-Selektivnährboden (each within 24 h).
The results of this dissertation have to be interpreted considering the following reservations. One has to be aware that merely sensitivity but not specificity was examined. Even more, the results of this study about the sensitivity of the examined media cannot be compared to results of other studies, that are based on the detection of MRSA in clinical samples, because our study is specifically based on a specially selected panel of (clinical) S. aureus isolates with PVL from different origins. It also needs to be considered that each of the examined groups of S. aureus consisted only of a small number of strains and groups also differed in number.
Our results on cefoxitin correspond to results of other studies, that show the reliability of cefoxitin in detecting a resistance to oxacillin [5],[6], [7], [8]. Results of this study also support observations of other authors concerning a lack of sensitivity in oxacillin based methods after 24h [9], [10], [11]. This phenomenon might be related to the heterogenic expression or insufficient induction. When trying to detect a resistance to meticillin by resistance testing methods, there generally is a problem with strains having MICs close or under the official limits. In case of doubt one should therefore consider additional testing for the mecA gene or the PBP2a antigene, if the typical clinical picture is displayed.
However, these cases are rare. The results of this study show that certain resistance testing methods can reliably detect the resistance to oxacillin even in MRSA with PVL. Accordingly, these methods can be regarded as slow but cost effective alternative in the routine laboratory, as compared to the detection of the mecA gene and its genetical product PBP2a.
[1]
Holden MTG et al.
Complete Genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: Evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance.
Proc. Natl. Acad. Sci. of the USA 2004; 101: 9786-9791.
[2]
Reischl U, Linde HJ, Metz M, Leppmeier B et al.
Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and simultaneous species confirmation using real-time fluorescence PCR.
J. Clin. Microbiol. 2000; 38: 2429-2433.
[3]
Herold BC, Immergluck LC, Maranan MC, Lauderdale DS, Gaskin RE, Boyle- Vavra S, Leitch CD, Daum RS.
Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in children with no identified predisposing risk.
JAMA 1998; 279:593-598.
[4]
Okuma K, Iwakawa K, Turnidge JD, Grubb WB et al.
Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community.
J.Clin.Microbiol. 2002; 40: 4289-4294.
[5]
Felten A, Grandry B, Lagrange PH, Casin I.
Evaluation of three techniques for detection of low-level methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): a disk diffusion method with cefoxitin and moxalactam, the Vitek 2 system, and the MRSA-screen latex agglutination test.
J. Clin. Microbiol. 2002; 40: 2766-2771.
[6]
Fang H, Hedin G.
Use of cefoxitin-based selective broth for improved detection of methicillin- resistant Staphylococcus aureus.
J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 592-594.
[7]
Perry JD, Davies A, Butterworth LA, Hopley AL et al.
Development and evaluation of a chromogenic agar medium for methicillin- resistant Staphylococcus aureus.
J. Clin. Microbiol. 2004; 42: 4519-4523.
[8]
Skov R, Smyth R, Larsen AR, Bolmstrom A et al.
Phenotypic Detection of Methicillin Resistance in Staphylococcus aureus by Disk Diffusion Testing and Etest on Mueller-Hinton Agar.
J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 4395-4399.
[9]
Becker K.
Diagnostik von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA)- Stämmen. Teil 2. Nachweis der Methicillin/Oxacillin-Resistenz bei Staphylococcus aureus.
Mikrobiologie 2004; 14: 41-50
[10]
Ben Nsira S, Dupuis M, Leclercq R.
Evaluation of MRSA Select, a new chromogenic medium for the detection of nasal carriage of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.
Int. J. Antimicrob. Agents 2006; 27: 561-564.
[11]
Swenson JM, Spargo J, Tenover FC, Ferraro MJ.
Optimal inoculation methods and quality control for the NCCLS oxacillin agar screen test for detection of oxacillin resistance in Staphylococcus aureus.
J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 3781-3784.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 05:20
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