| License: Publishing license for publications excluding print on demand (9MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-234833
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.23483
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 20 February 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer and apl. Prof. Dr Wolfram Gronwald |
| Date of exam: | 17 February 2012 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine |
| Keywords: | Polycystin-2, NMR, ADPKD, mDia1 |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 23483 |
Abstract (German)
Das PKD2 Gen ist eines der beiden mutierten Gene in Patienten, die an Autosomal-dominanter polyzystischer Nierenerkrankung leiden. Es kodiert für das Protein Polycystin-2, das aus 968 Aminosäuren besteht und aus sechs Transmembrandomänen und cytosolische N- und C-Termini aufgebaut ist. Für den cytosolischen C-Terminus wurden verschiedene Strukturmerkmale vorhergesagt und es ist eine Vielzahl an ...
Abstract (German)
Das PKD2 Gen ist eines der beiden mutierten Gene in Patienten, die an Autosomal-dominanter polyzystischer Nierenerkrankung leiden. Es kodiert für das Protein Polycystin-2, das aus 968 Aminosäuren besteht und aus sechs Transmembrandomänen und cytosolische N- und C-Termini aufgebaut ist. Für den cytosolischen C-Terminus wurden verschiedene Strukturmerkmale vorhergesagt und es ist eine Vielzahl an Interaktionspartnern, mit unterschiedlichsten Funktionen in der Zelle, bekannt. Ziel dieser Arbeit war es nun, mithilfe unterschiedlicher spektroskopischer Methoden detailliertere strukturelle und biochemische Informationen über den cytosolischen C-Terminus zu erhalten. Dafür wurden neben dem gesamten cytosolischen C-Terminus unterschiedliche Fragmente, die ein oder mehrere der Strukturmerkmale besitzen, einer strukturellen und biochemischen Analyse unterzogen. Weiterhin wurde die Interaktion mit dem Zytoskelett-assoziierte Protein mDia1 untersucht.
Für das Fragment PKD2C680-796 wurde bereits die NMR-Struktur am Lehrstuhl gelöst und die Existenz von zwei EF-Händen bewiesen. Innerhalb dieser Arbeit erfolgte die Zuordnung der Ringprotonen der Aromaten über 2D-(1H-1H)-TOCSY und –NOESY-Spektren für Tyr684, Tyr762, Phe738, Phe759, His709, His750, His773, His775 und His793. Weiterhin konnte über die Spektren die Existenz verschiedener Zustände aufgrund partieller Ca2+-Beladung gezeigt werden. Daraus konnte abgeleitet werden, dass die Sättigung beider EF-Hände mit Ca2+ für das Vorhanden sein einer wohldefinierten Struktur von großer Bedeutung ist. Diffusionsmessungen zeigen bei Bindung von Ca2+ eine Monomerisierung.
Für die vier Histidine His750, His773, His775 und His793 wurden mittels pH-Titrationen die pK-Werte bestimmt. Die pK-Werte von His773 und His775 sind durch die direkte Nähe zum Ca2+ in den EF-Händen, stark von der Beladung mit Ca2+ der EF-Hände beeinflusst und zeigen deutlich erniedrigte pK-Werte im Vergleich zum Durchschnitt für Histidine in Proteinen.
Die CD-spektroskopische Analyse zeigt bei vollständiger Beladung mit Ca2+ eine überwiegend alpha-helikale-Struktur aber auch einen hohen ungeordneten Anteil.
Bei der Hochdruck-NMR-spektroskopischen Untersuchung fanden sich für das partiell mit Ca2+-beladene PKD2C680-796 erneut Hinweise für das Vorliegen verschiedener Zustände. Bei Anwendung von Druck zeigte sich für die an der Ca2+-Bindung beteiligten Aminosäure starke Änderungen. In Abwesenheit von Ca2+ zeigten sich nur noch kleine druckbedingte Shifts. Die Vermutung liegt nahe, dass das Ca2+ durch Anwendung von Druck freigesetzt wird. Bei Betrachtung der EF-Hand-Mutanten konnte gezeigt werden, das bei Mutation der EF-Hand 1 immer noch die Bindung von Ca2+ an die EF-Hand 2 möglich ist (KD-Wert = 86 µM). Umgekehrt ist dies nicht der Fall. Der strukturelle Einfluss durch Mutationen an EF-Hand 1 im Vergleich zur EF-Hand 2 hingegen ist deutlich größer. Es konnte gezeigt werden, dass für die wohldefinierte Faltung des Proteinfragments beide (funktionierende) EF-Hände und deren Beladung mit Ca2+ wichtig sind.
Für das Fragment PKD2C680-796 konnte gezeigt werden, dass es anders als vermutet, von dem Zytoskelett-assoziierten mDia1(69-457) im Bereich der Ca2+-beladenen EF-Hände mit einem KD-Wert = 39 µM gebunden wird und von diesem wie eine Klammer umschlossen wird. Auch hier ist das Vorhandensein beider EF-Hände für die Bindung erforderlich.
Für das Fragment PKD2C725-880 wurden bei Ca2+-Zugabe die gleichen Veränderungen in den 1D-1H-Spektren und CD-Spektren wie auch im Fragment PKD2C680-796 gefunden. Im Bereich der EF-Hände und des Linkers dazwischen, sowie im Bereich des ER-Retentionssignals erfolgte eine Zuordnung der Resonanzen im 2D-(1H-15N)-HSQC. Mittels Diffusionsmessungen konnte gezeigt werden, dass PKD2C725-880 in Lösung als heterogenes Gemisch aus hohen Aggregaten und Dimer/Monomer (abhängig von der Ca2+-Beladung) vorliegt. Nach Abtrennung der Aggregate über eine Gelfiltrationssäule, kann das gleiche Monomer-/Dimer-Gleichgewicht, wie auch schon für PKD2C680-796, gezeigt werden
Für den gesamten cytosolischen C-Terminus PKD2C680-968 traten die identischen Veränderungen bei Ca2+-Zugabe auf, wie schon für PKD2C680-796 und 725-880. Auch in den Diffusionsmessungen zeigte sich erneut das Monomer-/Dimer-Gleichgewicht. Im Bereich des ER-Retentionssignals wurde in Abwesenheit von Ca2+ eine starke Reaktion auf pH-Änderungen oder die Anwesenheit von bivalenten Kationen gefunden. Die CD-Spektren zeigen einen überwiegend alpha-helikalen-Anteil.
Für das Fragment PKD2C797-968 wurde gezeigt, dass es in Lösung als heterogenes Gemisch vorliegt und im Bereich des ER-Retentionssignals wurde auch hier eine Sensitivität auf pH-Veränderungen oder die Anwesenheit von bivalenten Kationen gefunden. Die CD-Spektren zeigen einen überwiegend alpha-helikalen-Anteil.
Das nach Trypsinverdau erhaltene Fragment PKD2C828-900 liegt in Lösung als heterogenes Gemisch vor. Es zeigt keine Reaktionen auf Ca2+ und eine hohe Beweglichkeit am Ende der Coiled-Coil-Domäne. Die CD-Spektren zeigen einen überwiegendalpha-helikalen-Anteil.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle Fragmente, die die EF-Hände beinhalten, gleiche Veränderungen in den Spektren und ein Dimer-/Monomer-Gleichgewicht bei Ca2+-Zugabe zeigen. Alle Fragmente, die die Coiled-Coil-Domäne der Kristallstruktur beinhalten, zeigen in Lösung ein heterogenes Verhalten und zeigen Aggregation. Der Bereich des ER-Retentionssignals zeigt eine Sensitivität für pH-Änderungen oder die Anwesenheit von bivalenten Kationen.
Translation of the abstract (English)
The PKD2 gen is one of the two mutated gens in patients suffering from autosomal dominant polycystic kidney disease. It encodes for the protein polycystin-2, consisting of 968 amino acids, six transmembrane domains and cytosolic N- and C-termini. For the cytosolic C-terminus several structural features and a lot of interaction partners with different functions in the cell are known. The aim of ...
Translation of the abstract (English)
The PKD2 gen is one of the two mutated gens in patients suffering from autosomal dominant polycystic kidney disease. It encodes for the protein polycystin-2, consisting of 968 amino acids, six transmembrane domains and cytosolic N- and C-termini. For the cytosolic C-terminus several structural features and a lot of interaction partners with different functions in the cell are known. The aim of this work was, to gain structural and biochemical information about the cytosolic C-terminus by different spectroscopic methods. Therefore diverse fragments of the C-terminus, consisting of one or more structural features and the interaction with the protein mDia1 were analyzed.
There already exists a NMR structure of PKD2C680-796 and the existence of two EF hands could be demonstrated. Within this work the assignment of the protons of the aromatic rings by analyzing 2D-(1H-1H)-TOCSY and –NOESY-spectra for Tyr684, Tyr762, Phe738, Phe759, His709, His750, His773, His775 and His793 was made. Furthermore the evidence for different states depending on the saturation with Ca2+ could be shown. The saturation of both EF hands is important and necessary for a well folded structure of PKD2C680-796. NMR-diffusion measurements show monomerization upon Ca2+ binding.
For the four histidines His750, His773, His775 and His793 the pK-values were determined by pH-titrations. The pK-values for His773 and His775 are strongly affected by the bound Ca2+ in the EF hands and thereby lower than the mean value for histidines in proteins.
CD spectroscopic analysis shows predominantly an alpha-helical structure upon Ca2+ saturation.
High pressure NMR investigation shows again evidence for different states depending on the saturation with Ca2+. Application of high pressure shows changes for the amino acids involved in Ca2+ binding. In absence of Ca2+ there are only small pressure induced changes. Presumptive Ca2+ is released by high pressure.
For the EF hand mutants, mutation in EF hand 1 allows Ca2+ binding in EF hand 2 (KD-value = 86 µM) but not converse. The structural effect of mutation in EF hand 1 in contrast is much bigger. Both (functional) EF hands are important and necessary for a well folded structure of PKD2C680-796.
mDia1(69-457) binds PKD2C680-796 with a KD-value of 39 µM in the region of the two EF hands.
PKD2C725-880 shows the same changes upon Ca2+ binding in the 1D-1H-spectra and the CD-spectra, observed for PKD2C680-796. For the 2D-(1H-15N)-HSQC the assignment for the region of the EF hands and the linker between, and for the ER-Retention-signal could be made. NMR-diffusion measurements show monomerization upon Ca2+ binding and give evidence for high aggregates in solution.
For the whole cytosolic C-terminus PKD2C680-968 the same changes upon Ca2+ binding could be observed as for PKD2C680-796 and 725-880. NMR-diffusion measurements show again monomerization upon Ca2+ binding.
The region of the ER-Retention-signals shows strong reaction for variation in pH or the presence of bivalent cations. CD spectroscopic analysis shows predominantly an alpha-helical structure upon Ca2+ saturation.
For the fragment PKD2C797-968 there is evidence for high aggregates and a heterogene mixture in solution. The region of the ER-Retention-signals again shows strong reaction for variation in pH or the presence of bivalent cations. CD spectroscopic analysis shows predominantly an alpha-helical structure.
For the fragment PKD2C828-900 there is again evidence for high aggregates and a heterogene mixture in solution. This fragment shows no changes in addition of Ca2+ and a high mobility at the end of the coiled-coil domain. CD spectroscopic analysis shows predominantly an alpha-helical structure.
In summary all fragments consisting of the two EF hands show similar changes in spectra and a monomerization upon Ca2+ binding. All fragments consisting of the coiled-coil domain show a heterogene behavior in solution and aggregation. The Region of the ER-Retention-signal shows sensitivity for changes in pH or the presence of bivalent cations.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 05:01
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