| License: Publishing license for publications excluding print on demand (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-265624
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.26562
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 30 October 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Peter Angele |
| Date of exam: | 16 October 2012 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Unfallchirurgie |
| Keywords: | Seneszenz, mesenchymale Stammzellen, Östradiol, Tamoxifen, senescence, mesenchymal stem cells, estradiol |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 26562 |
Abstract (German)
Krankheiten des Knorpels stellen auf Grund ihrer Häufigkeit, der zunehmend alternden Bevölkerung und dem Gedanken, bis ins hohe Alter aktiv und fit bleiben zu wollen, ein großes Behandlungsfeld dar. Allerdings sind die Behandlungsoptionen auch heutzutage noch begrenzt. Da Knorpel ein bradytrophes Gewebe ist, sind seine Regenerationsmöglichkeiten stark begrenzt und die Behandlungsmethoden bis ...
Abstract (German)
Krankheiten des Knorpels stellen auf Grund ihrer Häufigkeit, der zunehmend alternden Bevölkerung und dem Gedanken, bis ins hohe Alter aktiv und fit bleiben zu wollen, ein großes Behandlungsfeld dar. Allerdings sind die Behandlungsoptionen auch heutzutage noch begrenzt. Da Knorpel ein bradytrophes Gewebe ist, sind seine Regenerationsmöglichkeiten stark begrenzt und die Behandlungsmethoden bis heute nicht ausreichend.
Neue Maßstäbe in diesem Bereich setzt das Tissue Engineering, das letztendlich das Ziel vom neu gezüchteten, voll funktionsfähigen Knorpeltransplantat verfolgt. Um diesen zu verwirklichen, werden zunächst Zellen benötigt, die dem Patienten als leistungsfähige Knorpelzellen implantiert werden können bzw. Zellen, die in der Lage sind, sich nach Replantation in ein Gelenk zu richtigen Knorpelzellen zu differenzieren. Hier kommen die mesenchymalen Stammzellen ins Spiel. Sie sind zum Einen leicht zu gewinnen, zum Anderen weisen sie ein hohes Differenzierungspotential auf. Im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen, nimmt die ethische und moralische Fragwürdigkeit keinen allzu großen Stellenwert ein. Allerdings gehen MSCs nach einer gewissen Anzahl an Zellteilungen in ein Stadium der Seneszenz über, in dem sie zwar metabolisch aktiv sind, aber ihre Teilungsfähigkeit weitestgehend eingebüßt haben. Mit zunehmendem Alter proliferieren die Zellen immer langsamer, bis sie schließlich ein Plateau erreichen. In diesem Stadium weisen sie typische morphologische Kennzeichen auf. Außerdem verkürzen sich ihre Telomere mit zunehmendem Alter stetig. Die Verkürzung der Telomere korreliert dabei mit der Abnahme der Proliferationsgeschwindigkeit. Lange Zeit wurden einzig und allein die Telomere als Ursache für das Altern gesehen. Mittlerweile geht man von einem komplexen Geschehen und multiplen Faktoren aus. Allerdings hat Seneszenz nicht nur den negativen Effekt des Alterns, sondern bietet zudem Schutz vor Entartung und Tumorentstehung.
Das Hormon Östrogen steht scheinbar mit dem Alterungsprozess des Knorpels in Verbindung. So ist eine Zunahme der Häufigkeit von Gelenkerkrankungen bei Frauen in der Menopause nach Abfall der Östrogenkonzentration zu beobachten.
In dieser Arbeit sollten ein Modell zur Untersuchung des Einflusses von Östrogen auf mesenchymale Stammzellen etabliert und die gängigen Methoden zur Bestimmung der Telomerlänge optimiert werden. Im Anschluss daran wurde der Einfluss von Östrogen sowie des Gegenspielers Tamoxifen auf mesenchymale Stammzellen hinsichtlich Proliferationsverhalten, Morphologie, ß-Galaktosidase-Expression und Telomerlänge untersucht. Zudem erfolgte die Bestimmung und Analyse der Expression von telomerassoziierten Genen, von Regulatoren des Zellzyklus und von DNA-Reparaturgenen. Hierzu wurden MSCs von drei verschiedenen Spendern unter jeweils acht verschiedenen Bedingungen kultiviert. Als Kontrolle diente eine Gruppe, die in normalem MSC-Medium gezüchtet wurde. Um die Auswirkung von Östrogen zu untersuchen, wurden Zellen in Medium mit unterschiedlich hoher Östrogenkonzentration kultiviert: Östrogen 10-7M, Östrogen 10-9M, Östrogen 10-11M. Eine weitere Untersuchungsbedingung, Tamoxifen 10-7M, diente als zweite Kontrollgruppe. Außerdem wurden noch Zellen, zu deren Medium Östrogen und Tamoxifen in äquimolaren Konzentrationen von 10-7M, 10-9M und 10-11M hinzugefügt wurde, hinsichtlich der oben genannten Kriterien untersucht. Die Kultivierung aller Gruppen erfolgte bis zur Seneszenz. Zu Beginn und am Ende, sowie zu den Passagezeitpunkten wurden Daten erhoben und zum Schluss analysiert.
Die MSCs stellten ihre Proliferation wie erwartet nach einer bestimmten Anzahl von Verdoppelungen ein, ihre Proliferation verlangsamte sich über den Zeitraum der Kultivierung zusehends. Die morphologischen Veränderungen nahmen im Verlauf zu und entwickelten sich hin zu den Seneszenz-typischen Merkmalen. Der β-Galaktosidase-Nachweis wurde gegen Ende der Kultivierung zunehmend positiv. Es konnten keine Unterschiede hinsichtlich Proliferation, Morphologie oder β-Galaktosidase-Expression zwischen den verschiedenen Untersuchungsbedingungen festgestellt werden.
Sowohl Östrogen in der 10-7 molaren, sowie Östrogen in der 10-9 molaren Kon-zentration konnte die Verkürzung der Telomerlänge verzögern. Die Zellen dieser beiden Versuchsgruppen verloren im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant weniger Basenpaare. Interessant ist, dass dieser Effekt durch Zugabe des Östrogen-Agonist-Antagonisten Tamoxifen komplett aufgehoben werden konnte, wohingegen Tamoxifen allein keinen Einfluss auf die Telomerlänge hatte.
Sowohl TRF1 als auch TRF2 sind Bestandteile des Shelterinkomplexes und werden als eine Art negative Regulatoren der Telomerverlängerung angesehen. Hinsichtlich ihrer Expression konnte für keines der beiden Gene ein Unterschied zwischen jungen und seneszenten Zellen gezeigt werden. Auch die Zugabe der Hormone beeinflusste die Expression von TRF1 oder TRF2 nicht.
p21 fungiert als Inhibitor der DNA-Synthese in seneszenten Zellen. Die p21-Expression stieg in den seneszenten MSCs signifikant an, allerdings war auch hier kein Unterschied zwischen den Untersuchungsbedingungen zu vermerken.
SIRT1 kann Apoptose und Seneszenz verzögern. Es konnte eine starke Erhöhung der SIRT1-Expression gezeigt werden, die allerdings nicht in der Lage war, das Auftreten der Seneszenz zu verhindern. Es zeigte sich keine Beeinflussung durch die Zugabe der Hormone Östrogen oder Tamoxifen.
Das XRCC5 Gen zählt zu den DNA-Reparaturgenen und wird in proliferierenden Zellen vermehrt exprimiert, wobei eine sinkende Expression bereits Hinweise auf relevante DNA-Schäden oder bevorstehende Apoptose liefert. In dieser Arbeit konnte eine signifikant verringerte XRCC5-Expression in den seneszenten Zellen der Kontrolle und aller Östrogengruppen nachgewiesen werden. Auch hier nahm die Behandlung mit Östrogen oder Tamoxifen keinen Einfluss auf die Genexpression.
Da auch die mesenchymalen Stammzellen der Seneszenz unterliegen, können sie das Problem der Knorpelregeneration momentan nicht vollständig lösen. Die Tatsache, dass Östrogen in bestimmten Dosen die Verkürzung der Telomere in vitro verlangsamen kann, steht im Einklang mit dem protektiven Effekt dieses Hormons auf den Knorpel in vivo. So könnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu führen, die Wirkung von Östrogen auf Knorpelgewebe weiter molekularbiologisch zu untersuchen und über eventuelle Therapiemöglichkeiten degenerativer Erkrankungen in vivo nachzudenken.
Translation of the abstract (English)
Due to their frequency diseases of the cartilage constitute a vast field of treatment caused by the increasingly aging population and their expectation to remain active and fit until old age. Even though the options for treatment remain limited even today. Being a bradytrophic tissue the possibilities of cartilage regeneration are highly restricted and methods of treatment are insufficient up ...
Translation of the abstract (English)
Due to their frequency diseases of the cartilage constitute a vast field of treatment
caused by the increasingly aging population and their expectation to remain active
and fit until old age. Even though the options for treatment remain limited even
today. Being a bradytrophic tissue the possibilities of cartilage regeneration are
highly restricted and methods of treatment are insufficient up to the day.
Tissue engineering sets new standards in this field, which ultimately has the aim of
using a newly cultivated and fully working cartilage transplant. In order to realize
this cells are needed which either can be implanted into the patient as working cartilage cells, or which are capable of differentiating into genuine cartilage cells after replanting into a joint. Here mesenchymal stem cells are needed. They are easy obtainable on the one hand and they show a high potential of differentiation on the other hand. In contrast to embryonic stem cells their use is hardly objected by ethic and moral principles. As a matter of fact MSCs reach a stage of senescence after a certain number of cell divisions, in which they are metabolically active, but have lost their potential of division. With growing age cell proliferation is decelerated until a plateau is reached. In this stage they show typical morphological features. Furthermore their telomeres steadily shorten with growing age. The shortening of telomeres correlates with the reduction of the proliferation speed. For a long time telomeres were considered the only cause of aging. In the mean time aging is seen as a complex process with multiple factors. But senescence does not only produce the negative effect of aging, it also protects against degeneration and the growth of tumors. The hormone estrogen seems to be related to the aging process of cartilage. Therefore an increasing number of degenerative diseases of the joints can be found in women in their menopause after a reduction of estrogen concentration.
In this paper a model of analyzing the influence of estrogen on mesenchymal stem cells and of optimizing the common methods determining the length of telomeres was to be established. More over the influence of estrogen and its antipode tamoxifen on MSCs regarding proliferation attitude, morphology, ß-galactosidase-expression and length of telomeres was examined. In addition the determination and analysis of the expression of telomere-associated genes, of the regulation of the cell cycle and of DNA repair was given. Therefore MSCs of three different donors were cultivated each under eight different conditions. A group cultivated in ordinary MSC-medium served as a controlling measure. In order to examine the effect of estrogen the cells were cultivated in media containing different high concentrations of estrogen: estrogen 10-7M, estrogen 10-9M, estrogen 10-11M. A further requirement of examination, tamoxifen 10-7M, served as a second control group. More over other cells cultivated in media to which estrogen and tamoxifen in equi-molar concentrations of 10-7M, 10-9M, and 10-11M were added were examined according to the criteria above mentioned. The cultivation of all groups continued till senescence. At the end and at the beginning, also during given points of time on the passage, data were collected and finally analyzed. As expected the MSCs stopped proliferating after a certain number of duplications, proliferation increasingly decelerated during the process of cultivation. The morphological changes increased along the process and the typical features of senescence were developed. The ß-galactosidase-proof turned out to be more and more positive at the end of cultivation. No differences could be found concerning proliferation, morphology or ß-galactosidase-expression among the different requirements of examination. Both estrogen 10-7 and estrogen 10-9 in their molar concentrations were able to decelerate the shortening of telomere length. The cells of these two groups significantly lost fewer pairs of bases compared to the control group. It has to be pointed out that this effect completely stopped when adding the estrogen-agonist-antagonist tamoxifen, whereas tamoxifen on its own did not affect the length of telomeres. TRF1 and as well as TRF2 are components of the sheltering-complex and are considered as negative regulation of telomere lengthening. According to their expression for none of the two genes a difference could be found between young and senescent cells. Even the addition of hormones did not affect the expression of TRF1 and TRF2. p21 inhibits DNA-synthesis in senescent cells. The p21 expression significantly increased in senescent MSCs. Even there no differences could be found among the experimental conditions.
SIRT1 can decelerate apoptosis and senescence. A high increase of SIRT1-expression could be realized, but it could not inhibit the incidence of senescence. The addition of the hormones estrogen or tamoxifen showed no influence. The XRCC5 gene is considered as one of the DNA-repair-genes and is experimented with
in proliferating cells in the course of which a declining expression already refers to relevant DNA-degeneration and the beginning of apoptosis. In this paper a significantly reduced XRCC5 expression in the senescent cells of the control group and in all estrogen groups could be shown. Even here a treatment with estrogen or tamoxifen had no influence on the gene expression. As MSCs undergo senescence, too, they cannot fully solve the problem of cartilage regeneration at the moment. The fact that estrogen in certain concentrations can decelerate telomere shortening in vitro correlates with the positive effect of this hormone on cartilage in vivo. Thus the results of this paper could lead to further molecular-biological research
into the effect of estrogen on cartilage tissue and reconsider possible methods of treatment for degenerative diseases in vivo.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 03:53
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