| License: Publishing license for publications excluding print on demand (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-268175
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.26817
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 30 November 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Kurz |
| Date of exam: | 22 November 2012 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Physiologie > Prof. Dr. Armin Kurtz |
| Keywords: | kidney, juxtaglomerular epitheloid cells, renin secretion, Niere, Reninsekretion |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 26817 |
Abstract (German)
Das Renin-Angiotensin-Aldosteron System ist von übergeordneter Wichtigkeit für die Kontolle des Salz- und Wasserhaushalts des Körpers. Sowohl die Regulation als auch der genaue Mechanismus der Reninsekretion aus den juxtaglomerulären Epitheloidzellen (JG-Zellen) der Niere, wird schon seit geraumer Zeit untersucht. Während zur Regulation der Reninsekretion eine Vielzahl von wissenschaftlichen ...
Abstract (German)
Das Renin-Angiotensin-Aldosteron System ist von übergeordneter Wichtigkeit für die Kontolle des Salz- und Wasserhaushalts des Körpers. Sowohl die Regulation als auch der genaue Mechanismus der Reninsekretion aus den juxtaglomerulären Epitheloidzellen (JG-Zellen) der Niere, wird schon seit geraumer Zeit untersucht. Während zur Regulation der Reninsekretion eine Vielzahl von wissenschaftlichen Arbeiten verfasst wurde, ist der genaue Sekretionsmechanismus noch relativ ungeklärt. Die klassische Mikroskopie mit Hilfe eines Transmissions-elektronenmikroskops (TEM) lieferte bisher wenig Hinweise auf einen klassischen Sekretionsmechanismus, wie beispielsweise Kontakte-von Vesikel- und Zellmembran oder Omega-Strukturen bei JG-Zellen. Darüber hinaus existieren widersprüchliche Angaben hinsichtlich der Morphologie und des Verhaltens der Reninspeichervesikel unter normalen sowie unter extrazellulären Bedingungen, welche die Reninsekretion stimulieren. Zudem liefern statische 2-dimensionale TEM-Aufnahmen nur ein unvollständiges Bild der Vesikelmorphologie und lassen großen Spielraum für Spekulationen. Aus diesem Grund wurden im Zuge dieser Arbeit die Morphologie und der Exozytosemechanismus der Reninspeichervesikel mit Hilfe von aus TEM-Aufnahmen erstellten 3-dimensionalen Teilrekonstruktionen von JG-Zellen untersucht. Die Rekonstruktionen wurden sowohl von Zellen unstimulierter Mausnieren, als auch von Zellen von Mausnieren, deren Reninsekretionsrate mit Hilfe der Arbeitstechnik der isoliert perfundierten Mausniere (IPN) in vivo pharmakologisch stimuliert und gemessen wurde, erstellt. Dabei wurden pro Stimulationsstufe JG-Zellen mehrerer Nieren elektronenmikroskopisch untersucht und daraufhin von maximal zwei repräsentativen Zellen beispielhaft 3-dimensionale Modelle aus TEM-Aufnahmen von 50-100 70 nm dicken Ultradünnschnitten erstellt. Untersuchungen an unstimulierten und mit steigender Intensität stimulierten Wildtyp-Zellen ergaben, dass viele Reninspeichervesikel keine klassisch runde Form aufweisen, sondern miteinander in Kontakt stehen und so ein sogenanntes Speichernetzwerk bilden. Die Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration mittels Isoproterenol oder Erniedrigung der extrazellulären Calcium-Konzentration mittels EGTA führte zu einer Stimulation der Reninsekretionsrate und zu einer Erhöhung des Vernetzungsgrads der Reninspeichervesikel. Desweitern konnten bei hohen Stimulationsstufen Exozytoseereignisse beobachtet werden, deren Zahl jedoch bei noch höherer Stimulation konstant blieb, obwohl die Reninsekretionsrate weiter zunahm. Es ist anzunehmen, dass eine intrazelluläre Verschmelzung von Vesikelmembranen für einen erhöhten Ausstoß von aktivem Renin in den Intrazellulärraum verantwortlich ist. Ein derartiger Ausstoß von gepeichertem Material wird als Compound-Exozytose bezeichnet.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden stimulierte und unstimulierte JG-Zellen von C57BL/6J-Lystbg-J/J-Mäusen untersucht. Der Phänotyp dieser Tiere ähnelt der Chediak-Higashi-Krankheit beim Menschen. Das bei diesem Genotyp ausgeknockte LYST- bzw. CHS1-Gen kodiert für das sogenannte lysosomal trafficking (LYST) Protein, welches auf bisher unbekannte Weise an der korrekten Ausbildung von lysosomalen Organellen beteiligt ist. Dementsprechend treten bei diesen, auch Beige-Mäuse genannten Tieren in mehreren Zellarten abnormal vergrößerte lysosomale Organellen und Granulen auf. Desweiteren weisen die JG-Zellen dieser Tiere eine abnormale Morphologie der Renin-speichervesikel auf. In der Tat waren sowohl in den für diese Arbeit angefertigten 3-dimensionalen Rekonstruktionen als auch auf TEM-Aufnahmen die Renin-speichervesikel der Beige-JG-Zellen deutlich vergrößert. Vier bis fünf sehr große, unregelmäßig geformte Reninspeichervesikel füllten fast das gesamte Zellvolumen der rekonstruierten Zellen aus. Unter Bedingungen, welche die Reninsekretionsrate stimulierten, konnten Exozytoseereignisse bei Beige-JG-Zellen beobachtet werden. Die Reninsekretionsrate der Beige-Mausnieren unterschied sich bei gleichen Stimulations-bedingungen nicht signifikant von der von Wildtyp-Mausnieren. Es ist anzunehmen, dass eine Fusion von Vesikel- und Zellmembran bei JG-Zellen im Allgemeinen nicht auf kleine Reninspeichervesikel beschränkt ist, sondern auch bei sehr großen kavernenartigen Vesikeln, wie sie in der Beige-Zelle auftreten, stattfindet.
Im dritten Teil der vorliegenden Dissertation wurden unstimulierte JG-Zellen von Ren-1d-Cre/Cre-Mäusen 3-dimensional rekonstruiert. Diese Mäuse produzieren kein funktionelles Ren-1-Protein mehr. Es wird schon lange vermutet, dass nur das Ren-1-Protein in sekretorischen Vesikeln gespeichert und durch regulierte Exozytose sezerniert wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen diesen Befund. Die in den erstellten 3-dimensionalen Rekonstruktionen sichtbaren Vesikel waren gegenüber Reninspeichervesikeln des Wildtyps deutlich verkleinert und erschienen auf TEM-Aufnahmen weniger elektronendicht als diese. Es hat den Anschein, dass die in den Ren-1d-Cre/Cre-Zellen gefundenen Strukturen eher die prinzipielle Fähigkeit der Reninzellen wiederspiegeln, Speichervesikel zu bilden, und dass in ihnen kein funktionelles Renin-Protein gespeichert wird.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, SNARE-Proteine und Proteine, die mit ihnen interagieren, auf immunhistochemischem Weg mittels Fluoreszenzfärbung nachzuweisen. Zu diesem Zweck wurden 5μm dicke Paraffin- oder Cryoschnitte von Nierengewebe angefertigt, an denen die JG-Zellen gefärbt wurden. Als Vergleichsgewebe und Positivkontrolle diente Gewebe von typischen (Pankreas, Nebenniere) und atypischen (Schilddrüse, Nebenschilddrüse) endo- und exokrinen Drüsen. In dieser Arbeit konnten auf immunhistochemischem Weg keine der von uns untersuchten Proteine nachgewiesen werden. Entweder ist keines der in dieser Arbeit untersuchten Proteine am Exozytosemechanismus der JG-Zellen beteiligt, oder diese Proteine liegen in den JG-Zellen in sehr geringer, nicht mit Hilfe von Antikörpern nachweisbarer Konzentration vor.
Translation of the abstract (English)
The Renin-Angiotensin-Aldosterone system plays a major role in the regulation of both salt and fluid homeostasis of the body. The regulation and the detailed mechanism of renin secretion out of the juxtaglomerular epitheloid cells (JG-cells) of the kidney has been investigated for quite a long time. However, the detailed secretion mechanism of the jg-cells is still unknown. Classical microscopy ...
Translation of the abstract (English)
The Renin-Angiotensin-Aldosterone system plays a major role in the regulation of both salt and fluid homeostasis of the body. The regulation and the detailed mechanism of renin secretion out of the juxtaglomerular epitheloid cells (JG-cells) of the kidney has been investigated for quite a long time. However, the detailed secretion mechanism of the jg-cells is still unknown. Classical microscopy with a transmission electron microscope (TEM) showed only little evidence for an classic exocytotic mechanism in these cells, such as contact between vesicle and cell membranes or omega-shaped structures. Moreover, conflicting information exists regarding the morphology and behaviour of renin containing vesicles under normal and secretion-stimulating conditions. This may be rooted in the fact that 2-dimensional TEM-images are not suited for proper research of the 3-dimensional vesicle morphology. For this reason, the morphology and the exocytotic mechanism of renin containing vesicles of mouse kidneys with both unstimulated and stimulated renin secretion was analyzed in the course of this work by 3-dimensional reconstructions made out of serial TEM-images. Several kidneys of each stage of stimulation were examined and a maximum of two exemplary 3-dimensional reconstructions of each stage were made out of a series of approximately 50-100 70nm thick slices.
The reconstructions of unstimulated wildtype cells and wildtype cells stimulated with isoproterenol/EGTA revealed many renin containing vesicles which were either small single granules or irregularly shaped and connected to each other, forming interconnected caverns. Stimulation of the renin secretion rate with isoproterenol (via a high intracellular cAMP-concentration) and EGTA (via a low intra- and extracellular concentration of calcium-ions) resulted in stronger networking of vesicles. During stages of strongly stimulated renin secretion rates, exocytotic events such as contacts of vesicles with the cell membrane were observed. One could speculate that an intracellular fusion of renin containing vesicles is responsible for an elevated output of active renin into the intercellular space. This mechanism has already been observed in other cells and is called "compound-exocytosis".
In the second part of this work, 3-dimensional reconstructions of unstimulated and stimulated JG-cells of C57BL/6J-Lystbg-J/J-mice (beige-mice) were made and analyzed. the phenotype of this mice is similar to the phenotype of the human chediak-higashi-syndrome (CHS). In these mice, there is no production of functional lysosomal trafficking protein (lyst), which plays a rather unknown role in the correct formation and fragmentation of lysosomal and secretory organelles. This results in partial albinism, immunodeficiency and significantly enlarged lysosomal and secretory organelles in many cell types. In JG-cells of stimulated and unstimulated beige mice, the renin containing vesicles were significantly enlarged and of abnormal morphology. In each cell, a small number of very large vesicles with irregular and/or pancake-like shapes existed. There was no difference regarding the morphology of the renin containing vesicles between unstimulated and stimulated beige cells. In stimulated beige-cells, exocytotic events were observed. The sum of these findings would indicate that fusion of vesicles with the cell membrane is not restricted to smaller vesicles but also occurs in very large renin containing vesicles of the beige-mouse.
In the third part of this work, unstimulated JG-cells of Ren-1d-CRE/CRE-mice were reconstructed and analyzed. These mice produce no functional glycosylated ren-1 protein, but only unglycosylated ren-2 protein. The results of this work support many other studies which postulate that only ren-1 protein is stored in secretory vesicles. 3-dimensional reconstructions of the JG-cells of ren-1-CRE/CRE-mice revealed only a small number of vesicular structures, which were significantly smaller compared to normal renin containing vesicles. This small vesicles probably reflect the principal capability of renin expressing cells developing special secretory structures.
Another aim of this study was the immunohistochemical detection of SNAREs and SNARE-associated proteins in JG-cells by fluorescently labeled antibodies. 5µm thick cryo-slices of kidney tissue and of control tissue of typical (pancreas, adrenal) and atypical (thyroid, parathyroid) endocrine and exocrine glands were made. However, during this study, none of the examined SNAREs and SNARE-associated proteins could be detected in JG-cells. This proteins are either lacking or expressed at very low levels only in JG-cells. It will be a task for future research to define the proteins relevant for fusion of renin storage vesicles among themselves and with the plasma membrane.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 03:43
Owner only: item control page
Download Statistics