Visualization and characterization of ribonucleoproteins in plants

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-271116
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.27111

Schönberger, Johannes Klaus

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Date of publication of this fulltext: 19 Dec 2012 08:22

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	19 December 2012
Referee:	Prof. Dr. Thomas Dresselhaus
Date of exam:	11 December 2012
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Klaus Grasser)
Keywords:	Ribonucleoproteins, RNA, Pflanzen
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	27111

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Abstract (English)

Abstract (English)

Polar cell division is a key mechanism for the development of any multicellular organism throughout all kingdoms of life. In order to cope with the challenge of how to establish a differential cell fate for daughter cells, which share a common mother, nature had come up with several solutions. One mechanism, which is found in all species from yeast to mammals, is the polar localization of mRNA to a distinct pole of the cell. While several pathways of unequal RNA distribution have been uncovered over the past few years in animals the kingdom of plants remains a “terra incognita” for this mechanism, although polar cell divisions occur frequently in plants. For example, the egg cell of Arabidopsis thaliana, is already a highly polarized cell and subsequent division of the zygote results in a small apical and a large basal cell. This knowledge led to the hypothesis, that this first very asymmetric cell division might be regulated by the distinct localization of mRNA within the egg cell.
To address this issue, two systems for RNA visualization were used, λN22 and MS2 respectively, which take advantage of the binding of virus-derived RNA binding proteins (RBP). These are fused to a fluorescent protein for visualization, to specific RNA stem loops. A vector series for both systems to be used in plants could be generated. For the first time, the functionality of the λN22 system in plants was shown. Furthermore the monitoring of the transport of mRNA in high-molecular ribonucleoprotein (RNP) particles in plant cells could be established for both systems. Intriguingly, the simultaneous use of both systems facilitated the parallel monitoring of two distinct RNPs, carrying two distinct RNAs. Holding this tool in hands, which include the binding proteins fused to CFP, GFP, mVenus or mCherry, respectively, and a Gateway™ based stem loop series, which enable high-throughput studies, is a great step forward in the elucidation of general processes of RNA transport within plant cells.
After establishing the RNA visualization in plants, the system was adopted for the monitoring of RNAs in the Arabidopsis egg cell. For this purpose, the egg cell specific promoter EC1.1 was used to drive expression of the detection systems. A special feature of this promoter is the immediate shutdown of expression after fertilization. This ensures the mRNA being of maternal origin. As subject of study, a list of genes was generated, of which the RNAs were investigated upon their localization in the egg cell by fusing them to the corresponding stem loops. This list was based on single cell array data from Arabidopsis and Maize egg cells and embryos, respectively, and includes transcription factors, RNA binding proteins and various other functions. The cloned RNA-loop constructs were crossed into a line, stably expressing the corresponding binding protein. The use of the system in the egg cell could be shown but so far, however, no candidate RNA showed a polar distribution in the egg cell.
Additionally, during the course of all experiments, λN22 showed a clear superiority over the MS2 system in terms of stability and reliability, thus promoting the preferential use of the first one.
In addition to the investigation of the RNA distribution in the egg cell, an endogenous RNA binding protein, RBP1, was examined more closely. RBP1 showed a similar behavior as the heterologous λN22 and MS2 systems respectively, as the formation of microscopically visible RNPs and their transport properties. Additionally, the transport of labeled RNA together with endogenous RBPs could be shown by the simultaneous use of the endogenous RBP and λN22. Further studies on this protein suggested association and transport of the formed RNPs with the actin cytoskeleton. Finally, RBP1 was expressed in the heterologous E. coli system. A method for purification could be established which enables subsequent experiments like binding assays, Co-IP and CLIPs, which will give a further insight into the nature of plant RNPs.
All those data together lay the groundwork for extensive studies of RNA distribution, transport, localization as well as RNP formation in plants, which will help to uncover the central role of mRNA.

Translation of the abstract (German)

Polare Zellteilung ist ein Schlüsselmechanismus bei der Entwicklung sämtlicher vielzelliger Organismen in allen Königreichen des Lebens. Um mit der Herausforderung, unterschiedliche Zellschicksale von Tochterzellen, welche von einer gemeinsamen Mutter abstammen, zu etablieren, kam die Natur auf mehrere Lösungen. Ein Mechanismus, welcher von der Hefe bis hin zum Menschen beschrieben wurde, ist die polare Verteilung von mRNA zu einem bestimmten Pol der Zelle. Während in Tieren einige dieser Prozesse in den letzten Jahren aufgeklärt werden konnten, bleibt das Königreich der Pflanzen eine Art „Terra incognita“ für diesen Mechanismus, obwohl auch in Pflanzen eine Reihe höchst polarer Zellteilungen stattfindet. Die Eizelle von Arabidopsis thaliana zum Beispiel ist bereits eine stark polare Zelle und die folgende erste Zellteilung der Zygote führt zur Entstehung einer kleinen Apikal- und einer großen Basalzelle. Mit diesem Wissen als Grundlage wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese erste asymmetrische Zellteilung durch die spezifische Lokalisierung von mRNA innerhalb der Eizelle gesteuert wird.
Um diese Frage zu beantworten wurden zwei Systeme zur RNA-Visualisierung, das λN22 und das MS2, verwendet. Diese nutzen die Eigenschaft viraler RNA Bindeproteine (RBP), welche zur Visualisierung mit Fluoreszenzproteinen fusioniert sind, an sequenzspezifische RNA-Strukturen zu binden. Es gelang, eine Vektorserie beider Systeme für den Gebrauch in Pflanzen zu generieren. Die Funktionalität des λN22 System konnte zum ersten Mal überhaupt in Pflanzen gezeigt werden. Zusätzlich konnte die Beobachtung des Transports von mRNA in hochmolekularen Ribonucleoproteinpartikeln (RNP) in Pflanzenzellen etabliert werden. Durch die parallele Anwendung beider Systeme war es zudem möglich, zwei unterschiedliche RNPs, welche unterschiedliche RNAs enthielten, zeitgleich zu detektieren. Somit wurde ein Werkzeug geschaffen, welches RBPs fusioniert mit CFP, GFP, mVenus und mCherry ebenso beinhaltet wie eine Gateway™ basierte Vektorserie für die Fusion mit den spezifischen RNA-Schleifen, und dadurch Hochdurchsatzanalyse von RNAs ermöglicht. Dies ist ein großer Schritt vorwärts bei den Bemühungen die allgemeinen Prozesse des RNA Transports in Pflanzenzellen zu verstehen.
Nachdem das Visualisierungssystem in Pflanzen etabliert werden konnte wurde es für die Beobachtung von mRNA in der Arabidopsis Eizelle adaptiert. Zu diesem Zweck wurde der eizellspezifische Promotor EC1.1 verwendet um die Expression beide Teile des Detektionssystems zu steuern. Eine besondere Eigenschaft dieses Promotors ist es, sofort nach der Befruchtung abgeschaltet zu werden. Dies stellt sicher, dass die untersuchte RNA maternalen Ursprungs ist. Es wurde eine Liste von Genen erstellt, deren RNAs auf eine polare Lokalisierung in der Eizelle hin untersucht werden sollen, indem sie mit den spezifischen RNA-Schleifen fusioniert werden. Diese Liste basiert auf den Microarray-Daten isolierter Arabidopsis Eizellen, den apikalen und basalen Zellen des frühen Maisembryos sowie Zellen des weiterentwickelten Embryos. Sie beinhaltet Transkriptionsfaktoren, RNA Bindeproteine sowie Transkripte unterschiedlichster Funktion. Die so klonierten RNA-Schleifen-Fusionen wurden in eine Pflanzenlinie gekreuzt, welche das entsprechende Bindeprotein stabil exprimiert. Die Funktionalität des Systems in der Eizelle konnte gezeigt werden, jedoch zeigte bisher keine der untersuchten RNAs eine polare Verteilung innerhalb der Eizelle.
Zusätzlich zeigte sich während sämtlicher Experimente eine klare Vorteilhaftigkeit des λN22 Systems gegenüber dem MS2 System in Bezug auf Stabilität und Zuverlässigkeit, weswegen es nun dauerhaft als Einziges zum Einsatz kommt.
Neben der Untersuchung der RNA Verteilung in der Eizelle wurde ein endogenes RNA Bindeprotein, nämlich RBP1 genauer charakterisiert. RBP1 zeigt ein ähnliches Verhalten wie die heterologen Systeme λN22 und MS2, wie die Bildung von mikroskopisch sichtbaren RNPs. Zusätzlich konnte durch die simultane Expression von RBP1 und λN22 der Transport von markierter RNA mittels eines endogenen RBPs gezeigt werden. Weiterführende Experimente deuten auf eine Assoziation des Transports von RBP1 Partikeln mit dem Aktin Cytoskelett hin. Abschließend wurde RBP1 heterolog in E. coli exprimiert. Eine Methode zur erfolgreichen Aufreinigung konnte etabliert werden, was in der Folge weitere Experiment wie die Untersuchung der Bindeeigenschaft, Co-Immunopräzipitation oder CLIP ermöglicht. Dies wird helfen die Natur von RBPs besser zu verstehen.
All diese Daten zusammengenommen haben das Fundament für extensive Untersuchungen der RNA Verteilung, Lokalisierung, des Transports und der Zusammensetzung von RNPs in Pflanzen gelegt, welche helfen werden, die zentrale Rolle von mRNA besser zu verstehen.

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