| License: Publishing license for publications excluding print on demand (1MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-273946
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.27394
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 23 January 2013 |
| Referee: | PD Dr. Wulf Schneider |
| Date of exam: | 21 January 2013 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Keywords: | Caspase-8, 14.7K, Adenovirus, Interaktion, Apoptose, adenoviral protein, apoptosis |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 27394 |
Abstract (German)
Der membranständige TNF-Rezeptor-1 (TNFR1) gehört zur Familie der Todesrezeptoren und wird vorwiegend durch Bindung von löslichem TNF stimuliert. Da der TNFR1 auf nahezu allen Zelltypen des Körpers exprimiert wird, stellt er aufgrund seiner konstitutiven Verbreitung den Hauptmediator der TNF-vermittelten biologischen Funktionen dar. Die Aktivierung des Rezeptors kann sowohl zur Einleitung der ...
Abstract (German)
Der membranständige TNF-Rezeptor-1 (TNFR1) gehört zur Familie der Todesrezeptoren und wird vorwiegend durch Bindung von löslichem TNF stimuliert. Da der TNFR1 auf nahezu allen Zelltypen des Körpers exprimiert wird, stellt er aufgrund seiner konstitutiven Verbreitung den Hauptmediator der TNF-vermittelten biologischen Funktionen dar. Die Aktivierung des Rezeptors kann sowohl zur Einleitung der Apoptose-Kaskade führen als auch MAP-Kinasen und den NFkB-Signalweg aktivieren. Während die beiden zuletzt genannten Signalwege von der Internalisierung des TNFR1 unabhängig ablaufen können, ist die Endozytose des Rezeptors für die Initiation des Zelltods unverzichtbar (Schütze et al. 1999). Dabei werden die Adapterproteine TRADD, FADD und Caspase-8 als sogenannter death inducing signaling complex (DISC), an die intrazelluläre Todesdomäne des Rezeptors rekrutiert. Hier kommt es schließlich zur autokatalytischen Aktivierung der Initiatorcaspase-8, welche nachfolgend die distale Caspasekaskade in Gang setzt, die zur Demontage des Zellgerüsts und der Zelle führt.
Die Expression des adenoviralen Proteins 14.7K kann Zellen vor TNF-induzierter Apoptose schützen, indem sowohl die Internalisierung als auch die Rekrutierung der Adapterproteine gehemmt wird. Schneider et al. konnten zudem zeigen, dass in 14.7K-exprimierenden Zellen keine Aktivierung der Initiatorcaspase-8 mehr stattfindet (Schneider-Brachert et al. 2006). Die direkte Interaktion von Caspase-8 und dem adenoviralen Protein 14.7K erschien daher als möglicher anti-apoptotischer Wirkmechanismus, welcher bis heute noch nicht vollkommen verstanden ist. Eine Interaktion von 14.7K und Caspase-8 wurde bereits von Chen et al. und Kim und Foster beschrieben, konnte jedoch nicht direkt in der lebenden Zelle nachgewiesen werden (P. Chen et al. 1998; Kim and Foster 2002).
In der vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht, ob es in der Zelle zu einer direkten Interaktion und Bindung von 14.7K und Caspase-8 kommt. Zudem wurde versucht, die Interaktionsregion beider Proteine durch verkürzte Genfragmente der Caspase-8 zu identifizieren.
Zunächst wurde über einen Zytotoxizitätsassay die 14.7K-vermittelte TNF-Resistenz verifiziert. Western-Blot-Analysen dieser Zellen zeigten, dass zudem in Anwesenheit von 14.7K die Aktivierung der Caspase-8, also ihre Prozessierung in ihre aktive Form, nach TNF-Stimulation deutlich geringer ausfällt als in der entsprechenden parentalen Zelllinie. Nachfolgend konnte auch die Aktivierung der distalen Caspasekaskade verhindert werden, was durch eine stark verringerte PARP-1 Spaltung in 14.7K-exprimierenden Zellen nachgewiesen wurde.
Durch die Transfektion unterschiedlicher Plasmidmengen wurde untersucht, ob ein erhöhtes Verhältnis von 14.7K zu Caspase-8 die durch Caspase-8-Überexpression induzierte Apoptose hemmen kann. Tatsächlich konnte der durch autokatalytische Spaltung der Caspase-8 verursachte Zelltod durch eine deutliche Überexpression von 14.7K vermindert werden. Zum Nachweis diente hier die Luciferase-Aktivität der Luciferase Renilla, welche in diesem Versuch co-transfiziert wurde. Eine direkte Interaktion von 14.7K und Caspase-8 schien daher wahrscheinlich.
Mit Hilfe des Mammalian Two-Hybrid Assays wurde deshalb untersucht, ob 14.7K und Caspase-8 in der Zelle miteinander interagieren. Zusätzlich wurde durch Expression definierter Genfragmente der Caspase-8 versucht, die Region der Bindung zu identifizieren.
Die Auswertung dieses Assays erwies sich jedoch als schwierig, da es zum Einen durch Überexpression der Caspase-8 im Vektor trotz gleichzeitiger Expression von 14.7K zu einem erheblichen Zellsterben kam. So konnte, angenommen es käme zur Bindung von 14.7K an die Proform der Caspase-8, diese Interaktion aufgrund des fehlenden Zellstoffwechsels nicht mehr nachgewiesen werden. Zum Anderen erfordert die Aktivierung der Caspase-8 die Abspaltung der N-terminalen Proteindomänen (death effector domains, DEDs), welche aber mit einem für den Test essentiellen tag fusioniert sind. Wird dieses tag abgespalten, kann keine Interaktion mehr detektiert werden, selbst wenn sie stattfindet. Auch die aus der Literatur bekannte Interaktion zwischen Caspase-8 und CrmA konnte aus diesem Grund in dem Assay nicht gezeigt werden.
Analog konnte daher keine Interaktion zwischen Caspase-8 und 14.7K nachgewiesen werden, obwohl der Zelltod durch den Caspaseinhibitor z-VAD verhindert werden konnte.
Auch der Ansatz, die Caspaseaktivierung und die damit verbundene Abspaltung des tags durch Verwendung von einzeln exprimierten Proteindomänen der Caspase-8 (DED-1, DED-2, p18, p10) zu umgehen, führte nicht zum erwarteten Ergebnis.
Zudem kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine nicht hinreichende Expression der betreffenden Proteine im Mammalian Two-Hybrid Assay zum Ausfall der Interaktion führte.
Im Western-Blot konnte auch die Proteinsynthese aus ungeklärten Gründen trotz verschiedender Transfektions- und Lysemethoden nur für wenige Konstrukte belegt werden.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit keine Interaktion zwischen der Caspase-8 oder ihren definierten Genfragmenten und dem adenoviralen Protein 14.7K nachgewiesen werden. Es zeigte sich jedoch, dass der Mammalian Two-Hybrid Assay speziell für den Nachweis einer Bindung zwischen der aktivierten Caspase-8 und 14.7K kein adäquater Test ist. Denn eine Interaktion der funktionalen, prozessierten Caspase-8 mit einem Interaktionspartner kann aufgrund der Abspaltung des N-terminalen tags, welches zur Detektion der Bindung erforderlich ist, nicht mehr nachgewiesen werden.
Translation of the abstract (English)
The membrane-bound TNF receptor 1 (TNFR1) belongs to the family of death receptors and is stimulated primarily by binding soluble TNF. As TNFR1 is expressed on almost all types of cell of the body, it constitutes the main mediator of the TNF-induced biological functions on account of its constitutive spread. The activation of the receptor may lead to the introduction of the apoptotic cascade as ...
Translation of the abstract (English)
The membrane-bound TNF receptor 1 (TNFR1) belongs to the family of death receptors and is stimulated primarily by binding soluble TNF. As TNFR1 is expressed on almost all types of cell of the body, it constitutes the main mediator of the TNF-induced biological functions on account of its constitutive spread. The activation of the receptor may lead to the introduction of the apoptotic cascade as well as to the activation of MAP kinases and the NFkB-signal path. Whilst the two signal paths mentioned last may proceed independently of the internalisation of TNFR1, the endocytosis of the receptor is indispensable for the initiation of the cell death (Schütze et al. 1999). In the process, the adapter proteins TRADD, FADD and caspase-8 as the so-called death inducing signalling complex (DISC) are recruited to the intra-cellular death domain of the receptor. In the end, the autocatalytic activation of initiator caspase-8 takes place which subsequently sets in motion the distal caspase cascade which leads to the disassembly of the cell framework and the cell.
The expression of the adenoviral protein 14.7K can protect cells against TNF-induced apoptosis by inhibiting the internalisation as well as the recruiting of the adapter proteins. Moreover, Schneider et al. were able to demonstrate that the initiator caspase-8 is no longer activated in 14.7K-expressing cells (Schneider-Brachert et al. 2006). The direct interaction of caspase-8 and the adenoviral protein 14.7K thus appeared as potential anti-apoptotic mechanism of action which up to now is not completely understood. An interaction of 14.7K and caspase-8 has already been described by Chen et al. and Kim and Foster, but could not be identified directly in a living cell (P. Chen et al. 1998; Kim and Foster 2002).
For this reason the present work attempts to examine whether a direct interaction and binding of 14.7K and caspase-8 occurs in the cell. In addition, attempts have been made to identify the interaction region of both proteins through shortened gene fragments of caspase-8.
First of all, a cytotoxicity assay was used to verify the 14.7K-induced TNF resistance. Western blot analyses of these cells revealed that in the presence of 14.7K the activation of caspase-8, thus the processing in its active form, is significantly lower after TNF-stimulation than in the corresponding parental cell line. Subsequently the activation of the distal caspase cascade could be prevented, which was substantiated by a considerably reduced PARP-1 separation in 14.7K-expressing cells.
By means of the transfection of different plasmid quantities, it was examined whether an increased ratio from 14.7K to caspase-8 can inhibit the apoptosis induced by caspase-8 overexpression. Indeed, the cell death caused by the autocatalytic cleavage of caspase-8 could be reduced by a distinct overexpression of 14.7K. Here, the luciferase activity of the luciferase Renilla, which was co-transfected in this test, was used for proof. A direct interaction of 14.7K and caspase-8 seemed probable for this reason.
Thus, the mammalian two-hybrid assay was used to examine whether 14.7K and caspase-8 also interact with each other in the cell. In addition, defined gene fragments of caspase-8 were used to identify the region of the binding.
However, the interpretation of this assay proved to be difficult because, on the one hand, considerable cell death occurred by overexpression of caspase-8 in the vector despite simultaneous expression of 14.7K. Thus, assuming a binding of 14.7K occurred to the pro-form of caspase-8, this interaction could no longer be established on account of the absent cellular metabolism. On the other hand, the activation of caspase-8 requires the separation of the N-terminal protein domains (death effector domains, DEDs), which, however, are merged with a tag essential for the test. If this tag is split off, no interaction can be detected any more, even if it takes place. The interaction between caspase-8 and CrmA known from literature could not be shown in the assay either for this reason.
Thus, no interaction could be proven between Caspase-8 and 14.7K either although cell death could be prevented by the caspase inhibitor z-VAD.
Moreover, the approach of bypassing caspase activation and the cleavage of the bound tags by using individual expressed protein domains of caspase-8 (DED-1, DED-2, p18, p10) did not lead to the expected result.
In addition, it cannot be ruled out that a non-sufficient expression of the proteins in question in the mammalian two-hybrid assay caused the absence of the interaction.
For unknown reasons, the protein synthesis could be proven in the western blot for a few working models only despite various transfection and lysis methods.
In summary, this paper could not prove any interaction between caspase-8 or its defined gene fragments and the adenoviral protein 14.7K. However, it has been shown that the mammalian two-hybrid assay in particular is no adequate test to prove a binding between activated caspase-8 and 14.7K. After all, an interaction of the functional processed caspase-8 with an interaction partner cannot be detected any more due to the cleavage of the N-terminal tag which is required for the detection of the binding.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 03:18
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